[发明专利]一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉；细胞裂解：加入DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，混匀后在65℃水浴30min；DNA提取：加入0.33mL浓度为KAc，冰浴20min，后酚:氯仿:异戊醇抽提，离心，取上清液加入无水乙醇沉淀，低温静置30min，离心收集沉淀；纯化处理：加入RNaseA，在37℃处理30min，后25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，低温离心5min；取上清液加入无水乙醇沉淀，挑取沉淀，漂洗，风干，溶于TE缓冲液中，保存备用。采用本方法提取的丝状真菌DNA量提高2倍，浓度达到277ng/μL，片段长≥20000bps，无降解，纯度高。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。

背景技术

真菌为低等真核生物，种类庞大而多样，近几年，随着高通量测序技术的提高，更多真菌完成了基因组测序。基因组学的深入分析促进了生物进化、系统发生学、药物靶基因、新基因和新编辑方式的发现及功能等研究。真菌基因组DNA的长度、浓度、纯度直接关系到真菌基因组的测序、组装和注释。在文库构建和高通量测序过程中，高质量和长片段的真菌基因组DNA能够减少拼接误差，更好的反映原始基因调控序列和基因结构，便于基因功能和表达调控模式注释。因此，简便快捷地提取高质量、长片段丝状真菌基因组DNA提取方案在高通量测序、基因工程领域尤为重要。

迄今，对于从真菌中提取染色体的方法已有许多研究，其中较为有效的方法是酶解法、氯化苄法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠(SDS)法等，后两种由于无需昂贵仪器和药品，应用更广泛。但是现有这4种常规真菌基因组DNA提取方法主要应用于真菌子实体DNA的提取，而非新鲜培养的菌丝体DNA的提取，且提取效率较低(时间长、产量低)、质量较低(片段长度短、存在蛋白残留及降解产物)。

由于真菌子实体组织结构紧密，细胞壁结构坚固，且多数实验样本为干燥或多年生子实体，其中色素、多糖等次生代谢产物丰富，如白僵菌子实体含有20种多糖，约占白僵菌总干质量3％-8％；这些不利因素给真菌基因组DNA的提取带来巨大困难，导致提取操作繁琐，时间较长，成本较高；提取产物的产量较低，降解严重，蛋白、色素等残留较多，纯度较低。

而组织材料新鲜是提取高质量真菌基因组DNA的关键，尤其是色素、多糖含量较高的真菌。新鲜培养的真菌菌丝体，多糖、色素等次生代谢产物含量较低，细胞分裂增殖活跃，DNA含量丰富，且真菌基因工程操作多数以菌丝体为操作对象。但新鲜真菌菌丝体含水率高，导致液氮研磨不充分；活性酶含量高，导致DNA易降解、操作过程中长链易于断裂；此外，现有的离体真菌DNA提取方法不适用于新鲜菌丝的DNA提取，且操作时间较长(≥10h)，尤其是裂解液裂解能力越强，提取率越高，但DNA片段短；反之亦然。因此还未有一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，解决了现有技术存在的问题。

本发明提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：

S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；

S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃水浴30min；