[发明专利]一种全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法

权利要求书

1.一种全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)采用O型口蹄疫病毒，对牛进行第一次免疫，第一次免疫后30～60d内，进行第二次免疫，第一次免疫后第120～150d内，进行第三次免疫；所述O型口蹄疫病毒包括以下三个谱系：东南亚拓扑型毒株、中国拓扑型毒株和中东南亚拓扑型毒株；所述第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫采用的O型口蹄疫病毒的谱系不同；

2)第三次免疫后，分离外周血单个核细胞，利用诱饵抗原筛选O型口蹄疫病毒抗原特异性单个B细胞；所述诱饵抗原包括生物素或荧光蛋白标记的O型口蹄疫病毒；

3)以步骤2)获得的O型口蹄疫病毒抗原特异性单个B细胞的cDNA为模板，扩增牛抗体重链和轻链的可变区基因；

4)以牛外周血单个核细胞总cDNA为模板，扩增牛抗体重链和轻链的全长序列，得到牛抗体重链和轻链的恒定区序列；

5)将步骤3)获得的牛抗体重链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体重链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长重链载体；将步骤3)获得的牛抗体轻链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体轻链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长轻链载体；

6)将步骤5)得到的全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体以1：(1～3)的质量比混合，共转染细胞，取转染细胞培养后取上清，纯化得到全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体；

所述步骤3)和4)没有先后顺序的限定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述东南亚拓扑型毒株包括O/GZ/CHA2010、O/BY/CHA/2010。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述中国拓扑型毒株包括O/HN/CHA/93、O/YUN/TAW/97。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述中东南亚拓扑型毒株包括O/Tibet/99、O/YS/CHA/2005、O/TAW/2/99、O/CHA/7/2011。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述荧光蛋白包括APC、PE或FITC。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述扩增包括巢式PCR扩增方法，所述巢式PCR扩增使用的引物包括IgG可变区外引物对、IgG可变区内引物对、IgM可变区外引物对、IgM可变区内引物对、IgD可变区外引物对、IgD可变区内引物对、Ig lambda外引物对和Ig lambda内引物对；IgG可变区外引物对、IgM可变区外引物对和IgD可变区外引物对的上游引物相同且如SEQ ID NO.1所示，IgG可变区外引物对、IgM可变区外引物对和IgD可变区外引物对的下游引物分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；IgG可变区内引物对、IgM可变区内引物对和IgD可变区内引物对的上游引物相同且如SEQ IDNO.5所示，IgG可变区内引物对、IgM可变区内引物对和IgD可变区内引物对的下游引物分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；Ig lambda外引物对的核苷酸序列如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示；Ig lambda内引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述扩增包括cDNA末端快速扩增方法，所述cDNA末端快速扩增使用的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的IgG重链5’RACE引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的IgG重链3’RACE引物、核苷酸序列如SEQID NO.15所示的IgG Lambda轻链5’RACE引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的IgGLambda轻链3’RACE引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的IgG Kappa轻链5’RACE引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的IgG Kappa轻链3’RACE引物。