[发明专利]一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌(Methanoculleus)的酶切方法，该方法包含以下步骤：(1)将窖泥中含量最高的30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属的代表性序列2‑4个；(2)各属代表性序列的酶切分析，从中找出来甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式3‑10种；(3)在全部30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列中逐一验证上述3‑10种特征性酶切方式。(4)经过确认的特征性酶切方式再进行实验验证。(5)最终确认至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定。本发明可达到从窖泥厌氧菌群中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的，比起常规测序鉴定节省大量时间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法，该方法原则上可以找出若干经济方便的针对16S rDNA全长序列的限制性内切酶方案，用于把甲烷囊菌属细菌与窖泥中其他菌属的厌氧培养菌落区分开来。实际应用时与每次都进行菌落测序相比可以节约大量的时间。

背景技术

窖泥中含有丰富的微生物菌群，其中厌氧菌和兼性厌氧菌占大多数。根据实验室既有的高通量测序数据显示，Aminobacterium，Clostridium，Methanoculleus，Sedimentibacter，Syntrophomonas五个属的微生物含量在古井窖泥微生物菌群结构中排名前五。并已知Aminobacterium(胺杆菌属)，Methanoculleus(甲烷囊菌属)，Sedimentibacterr(瘤胃球菌属)是窖泥中的优质菌属，研究表明它们能够改善浓香型大曲酒的风味，提升酒产品的质量。所以研究这些菌属的培养条件、鉴定方法，提高它们在窖泥微生物群落中的含量，对酒产品质量的提升具有重要意义。

对窖泥厌氧菌的培养实验证明Methanoculleus的细菌较难培养获得，因为严格的绝对厌氧是甲烷细菌的主要特征之一。甲烷囊菌属作为窖泥中的优质菌属，研究其各种生物学特征是有意义的，而这些工作的前提是要培养鉴定出甲烷囊菌属细菌。

目前窖泥中微生物的种属主要通过16S rDNA测序来鉴定，包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因。目前已知甲烷囊菌对白酒发酵很重要，但是很难得到纯的甲烷囊菌，原因之一是没有从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌的方法。利用16S rDNA限制性酶切分析法从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌就是本专利要解决的科学技术问题。

利用酶切鉴定甲烷囊菌的工作目前还未有报道，本专利设计的酶切方案能够快速地从窖泥中菌群的厌氧培养菌落中识别出甲烷囊菌，将来可以应用到窖泥中的甲烷囊菌属的鉴定工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定甲烷菌菌落的酶切方法。通过对窖泥中培养得到的厌氧菌的16S rDNA进行限制性酶切分析，使甲烷囊菌属细菌16S序列的酶切结果(酶切片段的数量和大小)区别于窖泥其他属细菌的酶切结果，这样就可达到从窖泥厌氧培养生长的菌落中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的。利用扩增16S rDNA限制性酶切片段分析法对甲烷囊菌进行快速鉴定，选择甲烷囊菌属为目标属，开展限制性酶切片段分析鉴定的研究工作。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

(1)优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属代表性序列

(2)各属代表性序列的酶切分析，找出甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式并在各个菌属逐一验证，确认至少一个甲烷囊菌特征性酶切方式；

(3)通过具体实验验证种特征性酶切方式有效性，最终确认的至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式并用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定；

具体实施方式