[发明专利]增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法

说明书

本发明公开了一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法。其中，该增强型VPR蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第55位、第102位、第134位和第166位，且第55位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；第102位的丝氨酸突变为苏氨酸；第134位的丝氨酸突变为异亮氨酸；第166位的丝氨酸突变为苏氨酸；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。本发明的增强型VPR蛋白在常温下就有较高的活性，因而在血浆游离核酸提取中不需要升温，减少核酸降解。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法。

背景技术

从血浆中提取游离核酸是胎儿无创产前筛查和肿瘤液体活检的关键实验步骤，因为游离核酸总量直接影响无创产前筛查和肿瘤液体活检的灵敏度和检测限。目前，有多种提取方法和商业化试剂盒可供选择，大致分为离心柱法和磁珠法两大类，在实验操作的简便性和游离核酸的提取量上存在一定的差异。离心柱法利用硅基质膜结合核酸，经离心作用去除杂质，然后从硅基质膜上洗脱核酸。磁珠法利用功能化的纳米磁珠结合核酸，利用磁力架吸附磁珠分离核酸和杂质，最后从纳米磁珠上洗脱核酸。与离心柱法相比，磁珠法不需要离心设备，操作简单且与移液工作站结合能实现血浆游离核酸的自动化提取。因此，对于每年有几十万甚至上百万的无创产前筛查样本的临床服务商，磁珠法比离心柱法更适合完成大规模样品的检测。

但是，无论离心柱法还是磁珠法，一般均使用蛋白酶K进行核小体组蛋白的消化。蛋白酶K是一种类枯草杆菌蛋白酶，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，且在尿素和SDS存在时蛋白较稳定，因此广泛应用于核酸提取。但是蛋白酶K的最适反应温度是50～60℃左右，需要升温设备对反应进行加热，升温过程中游离核酸可能发生降解。如果能用常温下高活性的酶替代蛋白酶K，就能简化实验操作，达到成本降低且提取量增加的效果。从嗜冷菌中发现的低温蛋白酶已被应用于洗涤剂中，从而提高常温下洗涤剂的水解污渍的能力。如果将这种低温蛋白酶改良后应用到核酸提取中，就能在常温下发挥较高的酶活，达到消化核小体组蛋白，释放游离核酸的目的，从而简化实验操作，达到成本降低且提取量增加的效果。

发明内容

本发明旨在提供一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法，以解决现有技术中蛋白酶K在血浆游离核酸提取中需要升温而导致核酸降解的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种增强型VPR蛋白。该增强型VPR蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第55位、第102位、第134位和第166位，且第55位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；第102位的丝氨酸突变为苏氨酸；第134位的丝氨酸突变为异亮氨酸；第166位的丝氨酸突变为苏氨酸；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。

进一步地，增强型VPR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述增强型VPR蛋白。