[发明专利]长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法

说明书

本发明提供了长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且可以获得较纯的毛囊干细胞，呈现典型的铺路石状，原代细胞生长速度较快，第三天就可以观察到细胞出现聚集性生长，第四天就可以看到较多呈现聚集性生长的细胞团块，第五天就可以长满培养皿的60%‑70%，且毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。经细胞染色体分析、毛囊干细胞标记物检测，以及细胞活力检测等结果表明，所构建的长江三角洲白山羊毛囊干细胞系活力旺盛、毛囊干细胞标记物阳性率高，可为研究皮肤细胞基因表达与通路调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种长江三角洲白山羊（海门山羊）毛囊干细胞分离培养方法。

背景技术

毛囊干细胞广泛的存在于皮肤毛囊结构中，属于成体干细胞，是毛囊中的原始细胞，具有多向分化潜能，能通过自身的分裂增殖产生机体所需的细胞，相比于胚胎干细胞及其他种类的成体干细胞，具有来源广泛、易培养与扩增、高度多能性等特点。

随着干细胞研究的不断深入，毛囊干细胞研究已成为国内外学者研究的热点。毛囊干细胞位于毛囊隆突部，对毛发周期的维持、组织维持和更新、皮肤损伤修复等密切相关。毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关，包括生长期、退化期和休止期。毛囊周期并不是固定不变的，在受到外界刺激如皮肤损伤或者剪毛等，毛囊干细胞发生募集，促进皮肤修复和毛发生成。毛囊是控制毛发周期性生长的重要结构，但是毛囊干细胞存在部位隐蔽，体外分离和培养仍有很大的困难。

目前主要的分离方法有机械分离法和酶消化法。单纯机械解离法是将毛干连同毛囊从皮肤组织中拔出，经1×PBS润洗后，把毛囊部分贴附于培养瓶或培养板中，待贴附牢固后加入含血清培养液，置于37℃，5% CO₂条件下进行原代培养。酶消化解离法是将皮肤组织块经1×PBS润洗后浸入温胰蛋白酶中进行消化处理后加入含血清培养液，置于37℃，5%CO₂条件下进行原代培养。

以上两种方法虽然均能获得毛囊干细胞细胞，但仍存在组织块贴附不牢、细胞因酶消化和机械分离而损伤等不足，且经多次传代后较多细胞出现异常二倍体核型，以致丧失其生物学特性。

目前国内外关于山羊毛囊干细胞的研究报道相对较少，大多集中在细毛羊和绒山羊。长江三角洲白山羊是唯一能生产三类笔料毛的山羊，长江三角洲白山羊毛囊干细胞的研究对于我国长江三角洲白山羊产业发展具有重要的意义，不仅可为长江三角洲白山羊羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究奠定坚实的理论基础，而且可为羊毛品质、产量和质量的提高提供重要的理论和技术支持。因此，研发出一种江三角洲白山羊毛囊干细胞的制备方法，对于羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种长江三角洲白山羊（海门山羊）毛囊干细胞分离培养方法，用于解决现有技术中，毛囊干细胞的制备方法中存在不足和技术缺陷，在短时间内获得较纯的毛囊干细胞。

本发明的技术方案如下：

长江三角洲白山羊毛囊干细胞的分离培养方法，首先是皮肤组织样品的选择，本发明中所用的样品来源于海门山羊，选取120天胎龄左右的胎羊，采集颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；用手术刀切成2mm大小的组织块，放入胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；随即拿出并更换含10%胎牛血清的培养液，并在体视显微镜下用外科神经镊挑取毛囊；把收集到的毛囊组织再次放入0.25%胰蛋白酶中37℃消化30min后，用手持匀浆器匀浆30s过200目细胞筛，37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；待原代毛囊干细胞生长至汇合60%-70%时，进行传代培养，采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且可以获得较为较纯的毛囊干细胞，毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。

建立长江三角洲白山羊毛囊干细胞的过程如下：