[发明专利]靶向ERRα基因的慢病毒重组载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.靶向ERRα基因的慢病毒重组载体，其特征在于：包括pLVX-shRNA1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列和靶向ERRα基因的寡核苷酸链序列；所述寡核苷酸链序列包括正义链序列和反义链序列，序列结构包括BamH I酶切位点、靶核苷酸序列、茎环结构、靶序列互补序列、终止序列和AATT；所述多克隆位点序列包括BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点；

所述正义链序列选自gatccctgcaaagccttcttcaagttcaagagacttgaagaaggctttgcagtttttt ，即SEQ ID NO：3；所述反义链序列选自aattaaaaaactgcaaagccttcttcaagtctcttgaacttgaagaaggctttgcagg，即SEQ ID NO：4。

2.根据权利要求1所述的靶向ERRα基因的慢病毒重组载体，其特征在于：所述pLVX-shRNA1表达载体购自Clontech 公司。

3.根据权利要求1所述的靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）寡核苷酸链序列的设计与合成：根据GenBank中ERRα的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用软件对潜在靶mRNA序列的二级结构进行评估，筛选得到19nt靶核苷酸序列ctgcaaagccttcttcaag，进而设计并合成得到靶向ERRα基因的寡核苷酸链序列；

2）靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的构建：将pLVX-shRNA1用EcoR I和BamH I双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收pLVX-shRNA1长片段，与经退火处理的所述寡核苷酸链序列经T4DNA连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素的TB平板上；

3）靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的抽提：挑取TB平板上的单克隆，培养并利用质粒小提试剂盒提取重组质粒，得到靶向ERRα基因的慢病毒重组载体。

4.根据权利要求3所述的靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于：还包括如下步骤：

4）靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的鉴定：将提取得到的慢病毒重组载体进行双酶切和测序鉴定，测序鉴定正确。

5.根据权利要求3或4所述的靶向ERRα基因的慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于：所述感受态大肠杆菌为JM107。

6.一种ERRα基因沉默肺癌细胞株，其特征在于：所述ERRα基因沉默肺癌细胞株的构建方法包括如下步骤：

S1 ERRα基因沉默慢病毒的包装：培养293T细胞，取权利要求1至2中任一项所述的靶向ERRα基因的慢病毒重组载体转染293T细胞，利用慢病毒包装试剂盒包装慢病毒，离心，收集得到病毒液；

S2 ERRα基因沉默肺癌细胞株的构建：培养肺癌细胞，使用所述病毒液感染肺癌细胞，感染成功后培养并用嘌呤霉素筛选细胞，得到ERRα基因沉默肺癌细胞株。