[发明专利]用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物

说明书

本发明公开了一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物，所述引物上游P1：5'‑TTAGCTTATATGGATGCTGGTGGTTCATTC‑3'，下游引物P2：5'‑TTACTTCTCAAGGACCAACTAGAGTCATTG‑3'，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还提供一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA方法，该方法包括引物合成，待测样品中DNA的提取、RPA扩增以及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，为基层兽医工作者有效检测和鉴定丝状支原体山羊亚种引起的羊支原体性肺炎提供一种快速、便捷、特异的诊断方法。

技术领域

本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物及应用。

背景技术

丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎(Mycoplasma pneumonia of goats and sheep, MPGS)的病原之一。MPGS传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源(贺英等,2009; 万一元等, 2000)。MPGS的潜伏期平均为18-20d，最快3-6d，最长为30-40d。其临床特征主要表现为高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。该病的发病率为19%-90%，死亡率高达40%（贺英等, 2009）。当前国外非洲(Kama-Kama et al., 2016)、西班牙(Juan et al.,2016)、意大利(Corona Let al., 2014; Gillara et al.,2015)、美国(Algire et al., 2012)、约旦(D’Angelo etal.,2010)，国内四川(杜永凤，2008)、贵州(王慧等, 2013)、内蒙古(Xu et al, 2014)、青海(韩赟等, 2010)、广西(陶立等, 2015)、福建(江锦秀等, 2016)等地均有该病发生的报道。该病给养羊业造成了严重的经济损失，因此，亟需建立一种Mmc特异、敏感、简便的检测方法。

常规PCR技术以其能够检测痕量的病因DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增（RecombinasePolymerase Amplification, RPA）技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链节和蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前已用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测;医学临床诊断，代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。

丝状支原体山羊亚种的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和SYBR Green I RF-PCR，然而Mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物及应用。本发明的RPA引物特异性强，能够检测丝状支原体山羊亚种，为快速检测丝状支原体山羊亚种提供一种有效方法，便于兽医基层工作者使用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：