[发明专利]一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物

说明书

本发明公开了一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，所述引物上游P1：5'‑CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC‑3'，下游引物P2：5'‑GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATAT TTG‑3'，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA方法，包括引物合成，待测样品中DNA的提取、RPA扩增以及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，为基层兽医工作者有效检测和鉴定绵羊肺炎支原体提供一种快速、便捷、特异的诊断方法。

技术领域

本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物及方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)是引起羊支原体性肺炎(Mycoplasma pneumonia of goats and sheep, MPGS)的主要病原。MPGS传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源。MPGS临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，发病率为20%～30%，病死率一般为30%～50%，有的高达80%。当前国外非洲、西班牙、意大利、美国、约旦，国内四川、贵州、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道，给养羊业造成了严重的经济损失。

常规PCR技术以其能够检测痕量的病因DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增（RecombinasePolymerase Amplification, RPA）技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链节和蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前已用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测；医学临床诊断，代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。

绵羊肺炎支原体的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和SYBR Green I RF-PCR，然而Mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物及检测方法。本发明的RPA引物特异性强，能够检测绵羊肺炎支原体，为快速检测绵羊肺炎支原体提供一种有效方法，便于兽医基层工作者使用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，其中，所述RPA引物的核苷酸序列为：引物上游P1: 5'- CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC -3'，下游引物P2：5'-GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG -3'。扩增片段大小为353 bp。

上述RPA引物用于制备检测绵羊肺炎支原体的试剂。

一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA方法，包括以下步骤：

1)引物合成：合成所述RPA引物；

2)DNA模板提取：提取样品中的DNA；