[发明专利]一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体

说明书

本发明公开了一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体，属于工业生物技术领域。本发明基于角蛋白酶三维结构模型，针对角蛋白酶的酶蛋白Loop区域上的8个关键氨基酸残基位点，采用一步反向PCR构建热稳定性突变重组菌，热稳定性研究结果显示突变体N218S角蛋白酶在60℃的热稳定性提高了3倍以上。利用角蛋白酶进行降解羽毛研究。观察到角蛋白酶处理48h后的羽毛表面呈现开叉、毛糙状，羽毛降解率达到25％，羽毛降解液中氨基酸总含量增加了1.82mg/mL。该研究为降解羽毛制备高质量饲料以及降解硬质角蛋白废弃物奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白结构复杂、刚性强，含有丰富的二硫键，因此难以被普通蛋白酶降解。角蛋白酶是能够特异性降解羽毛、羊毛、毛发、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶类。其首先通过二硫键还原作用打开角蛋白中复杂的二硫键，进而通过蛋白水解作用实现角蛋白的降解。角蛋白酶的特殊性使其能够广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中。

总结已有研究来看，角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。其中热稳定性不足的问题使得在实际应用中通常需要通过加热来加速反应，提高了能耗，且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热，因此，热稳定的角蛋白酶在实际应用中非常重要。提高酶热稳定性的方法包括添加保护剂、酶的化学修饰、固定化以及蛋白质工程改造等。基于蛋白质三维结构的定点突变改造是改变酶热稳定性的有效方法，近年来，建立在分子信息学基础上的蛋白质工程技术获得了长足的发展，基于蛋白质的晶体结构或同源模型，利用计算机辅助设计能对角蛋白酶进行半理性或理性的蛋白质工程改造，为提高角蛋白酶的热稳定性提供可行的技术手段。美国国立生物技术信息中心(NCBI)和蛋白质数据库(PDB)中存在角蛋白酶保守位点和蛋白质结构等信息，通过对信息的初步检索、分析以及进行计算机预测，确定热稳定性改造的潜在位点，进而构建突变体，进行体外实验验证，考察重组酶的表达情况及其热稳定性。

随着绿色产业的推动，迫切需要角蛋白酶产业化的实现，但目前角蛋白酶的稳定性总体仍未达到商业化应用的需求。早期研究中本课题组也对角蛋白酶(Bpker)进行了热稳定性改造，但亲本的酶活明显偏低，发酵最高酶活仅为70U/mL(CN107828765A)。课题组前期已构建获得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶KerBv重组菌，在5L发酵罐上角蛋白酶活力高达7000U/mL以上，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该菌株的热稳定性还不适用于工业应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明在构建角蛋白酶KerBv三维结构模型的基础上，采用定点突变改造策略提升角蛋白酶的热稳定性，重点对热稳定性影响关键的Loop区域中的位点进行突变改造，提高该高酶活重组菌所产角蛋白酶的稳定性，将能够更好地服务于应用，具有更大的市场价值及应用潜力。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶的第118位天冬酰胺、第218位天冬酰胺、第236位丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第118位天冬酰胺突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第218位天冬酰胺突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第236位丝氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母、丝状真菌中的任意一种为宿主菌。