[发明专利]从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途

说明书

本发明公开了一种使用源自血红细胞(RBC)的细胞外囊泡(EV)进行RNA递送的方法。该方法包括血红细胞细胞外囊泡的提纯和电穿孔，并将RNA导入细胞外囊泡，同时将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。该方法还包括使用载有RNA的细胞外囊泡治疗癌症。

序列清单

与专利申请一起提交的标题为“序列清单”的序列清单文件具有6,395字节的大小及2017年8月16日的创建日期，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因组编辑领域，更具体地涉及通过细胞外囊泡(EV)将遗传物质转移到受体细胞。

背景技术

包括反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)、小干扰RNA(siRNA)、合成mRNA和基因组编辑RNA-蛋白质复合物的RNA治疗剂是用于以高特异性和高灵活性靶向人类基因组的新兴治疗方式。ASO和siRNA已作为敲低基因的工具已被广泛地用于生物医学研究中。它们能将任何感兴趣基因沉默从而在靶向疾病重要基因方面具有巨大潜力。可以使用各种化学修饰或缀合来保持ASO和siRNA稳定并增强其结合特异性。用于RNA转染的常用方法包括核转染(nucleofection)、脂质转染(lipofection)和电穿孔(electroporation)，其仅适用于体外递送。病毒转导和纳米颗粒通常用于体内递送RNA和DNA，然而，这些方法通常效率低、具有免疫原性和有毒。

科学最新突破之一是基因组编辑的新技术——定期聚集间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)方法，其能够对基因组DNA进行稳健和精确的修饰，以广泛地用于多种研究和医学中。CRISPR是纠正癌症遗传异常的理想工具，因为该系统可以设计为直接靶向基因组DNA。CRISPR系统涉及两个主要组分：Cas9酶和指导(gRNA)。gRNA含有用于DNA结合的靶向序列和用于Cas9结合的支架序列。Cas9核酸酶通常用于“敲除”靶基因，因此它可用于删除或抑制对癌症起始或发展必不可少的致癌基因。与ASO和siRNA类似，CRISPR系统在靶向任何感兴趣的基因方面提供了高灵活性，因此可以基于个体患者的基因突变设计潜在的基于CRISPR的疗法。CRISPR系统的一个优点是其完全消除疾病基因表达的能力，这些疾病基因只能通过使用ASO或siRNA的RNA干扰方法部分抑制。此外，可以使用多种gRNA同时抑制或激活多种基因，从而提高治疗效率并降低可能由靶基因中的新突变引起的抗性。CRISPR技术的应用已经从针对不同疾病的工作台快速发展到临床。CRISPR介导的T细胞修饰用于癌症治疗的临床试验已在中国和美国开始。许多其他基于CRISPR的疗法正在开发中。然而，这些疗法中的大多数依赖于靶细胞的体外修饰或使用可靶向极少数细胞类型(例如肝细胞)的病毒或纳米颗粒的CRISPR系统全身递送。

急性髓性白血病(AML)是最具攻击性的血癌类型，每年影响近352,000人，5年存活率为1.5％。急性髓性白血病的特征在于外周血(PB)和骨髓(BM)中成髓细胞的增加。30-40％的急性髓性白血病患者(大多数在60岁以下)对化疗和造血干细胞移植反应良好。然而，老年患者的反应率要低得多，因为他们无法忍受化疗的毒性。此外，由于耐药性，几乎所有患者在一定时间后复发。因此，需要新的治疗策略来提高反应率、降低毒性和对抗药物抗性。基因组学的最新进展提供了对急性髓性白血病遗传和表观遗传异常的更好理解，并提出了新的特异性治疗靶点。RNA干扰和基因组编辑方法逐步成为针对这些异常的新方法。然而，已证明向急性髓性白血病细胞递送RNA的基因治疗具有难度，尤其是对于体内治疗。常见的基因治疗递送载体如腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和脂质纳米颗粒(LNP)在急性髓性白血病模型中大多无效或有毒。

因此，需要提高递送效率并降低癌症基因疗法的毒性。

发明内容