[发明专利]一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用，属于工业生物技术领域。本发明成功构建了携带16种不同启动子序列的角蛋白酶重组菌，其中7种能够提高角蛋白酶表达量，PaprE启动子改造重组菌的酶活水平最高，达到2605U/mL，相比对照菌提高20倍。在5L发酵罐上发酵液中角蛋白酶活力高达7176U/mL，是目前文献报道重组角蛋白酶表达的最高水平，能更好地服务于实际应用。本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效策略。传统基因工程改造通常需构建高通量筛选方法，进行大量文库筛选，工作量大、周期长、成本高，该改造方法相比传统方法极大的减小了工作量，提高了高表达效率。

技术领域

本发明涉及一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白是一种不溶性的结构蛋白，因二硫键和氢键的高度交联而具有高稳定性。作为畜牧业、制革业和纺织业发展过程的副产品，每年均有大量的毛发弃置于自然界，对环境造成了巨大污染。目前，处理毛发主要通过高温、高压、酸、碱、氧化等物理化学方法进行降解，但这些方法会损耗角蛋白中有用的氨基酸，并且效率低、能耗高、污染大。角蛋白酶通过二硫键还原作用打开角蛋白中复杂的二硫键，进而通过蛋白水解作用实现角蛋白的降解。采用角蛋白酶降解角蛋白是一种绿色的降解过程，从经济和环保的角度，这种对环境友好的生物处理方式具有广阔的前景。

然而，总结已有研究来看，目前角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。虽然已有很多不同微生物来源的角蛋白酶基因成功实现异源表达的文献报道，但大部分基因工程菌的角蛋白酶表达水平一直未突破，使实现角蛋白酶的广泛应用及满足工业化大规模使用需求成为难点。近年来研究人员逐渐把研究重点转移到角蛋白酶的异源高效表达上，基因工程改造手段是提高重组角蛋白酶表达水平的关键方法。Radha利用诱导型启动子PxylA和PamyL实现了角蛋白酶在巨大芽孢杆菌中的高效表达，使重组酶的表达水平比对照菌高约3倍，酶活达到168.6U/mL(Radha S,et al.Bioresour Technol,2008,99:5528-5537)。Wang等人将多个拷贝数的角蛋白酶基因整合到地衣芽孢杆菌基因组上，构建了能稳定高产角蛋白酶的重组菌(Wang J J,et al.Biotechnol Bioeng,2004,87:459-464)。而通过启动子改造实现角蛋白酶的高效表达目前仍未见任何文献报道，这对于对实现角蛋白酶的深入和广泛应用也具有重大意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种角蛋白酶异源高效表达的启动子，提高角蛋白酶表达量和酶活。

本发明的第一个目的是提供一种启动子，所述启动子为角蛋白酶基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列为如SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.17～19具有95％以上同源性的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述的启动子的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为适于芽孢杆菌表达的载体。

本发明的第三个目的是提供一种表达角蛋白酶的重组菌，所述重组菌含有上述的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

本发明的第四个目的是提供一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：