[发明专利]用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用。所述培养基包含以下组分：(1)基础培养基，和(2)金精三羧酸或金精三羧酸铵盐，其中所述基础培养基无血清、无动物性蛋白和植物性蛋白，且不包含胰岛素、IGF‑1及转铁蛋白等成分。本发明提供的培养基能够有效改善哺乳动物细胞的乳酸代谢水平，同时能够提高哺乳动物细胞的活细胞密度、细胞活率以及外源蛋白表达。

技术领域

本发明涉及细胞培养和蛋白重组表达技术领域，尤其涉及一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用。

背景技术

CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是目前用于包括工程抗体和重组蛋白在内的生物技术药物研发和生产中最重要、最广泛的表达系统之一。与其他表达系统相比，它具有以下优势：作为一种转化细胞，理论上具有无限寿命，可以传代百代以上；属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；此外，该细胞还可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的一种理想宿主。

用以培养CHO细胞的培养基含有丰富的营养物质，部分营养物质会被转化为具有细胞毒性的代谢副产物。其中，乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产物。CHO细胞在代谢旺盛的对数生长期通常会进行乳酸的快速累积，部分细胞株可以在稳定期发生代谢转变，能将这些乳酸代谢消耗掉，但部分细胞株却缺乏此代谢转变能力。大量乳酸的累积将严重影响蛋白表达及蛋白质量。乳酸的累积会导致培养体系的pH降低，为使pH回升添加的碱液往往会增加体系的渗透压，从而影响细胞正常生长代谢。而如果不通过添加碱液调节pH，低pH环境会影响酶活，从而影响细胞生长。

为了改善细胞的生长，提高蛋白产量及质量，获得稳定持续的培养过程，减少乳酸积累一直是细胞培养过程中的一个巨大挑战。现有技术中减少乳酸积累的方法包括：(1)对细胞进行基因改造可以降低乳酸积累，如敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因、过表达丙酮酸羧化酶(PYC2)基因等，但操作性不强。(2)也可优化细胞培养策略进行乳酸调控。用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源可以降低乳酸的积累，如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖的使用，但相对而言，都具有较大的副作用。而当乳酸有一定积累时，可以通过葡萄糖的浓度来改变细胞的代谢路径，从而减少乳酸累积。但这些乳酸调控策略会对细胞的生长及蛋白质量产生不利影响。(3)此外，铜离子(Cu²⁺)的添加曾在多种CHO细胞中被证实可以减少乳酸积累。Cu²⁺的加入可扩大线粒体的氧化容量，从而降低乳酸的积累。但目前大多数商用培养基中Cu²⁺的浓度设计比较均衡而合适，在额外添加时，很多情况下作用并不明显，同时Cu²⁺的添加会影响到蛋白的质量，如增加碱性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。因此，目前市场急需开发一种能够调控乳酸代谢的更适宜的方法。

培养基是影响细胞生长代谢乃至生存的最直接、最重要的环境因素。在悬浮培养和无血清培养已成为动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择的现阶段，本发明的发明人提供一种可显著降低乳酸累积的支持CHO细胞悬浮培养的无血清培养基。Hyclone公司生产的ActiPro培养基和Gibco公司生产的Dynamis培养基是针对CHO细胞悬浮培养较常用的无血清、无蛋白且化学成分限定的商品化培养基。以添加适宜浓度的金精三羧酸或金精三羧酸铵盐的ActiPro或Dynamis为基础培养基进行细胞培养，可有效调控乳酸的堆积问题。