[发明专利]一种提高铁皮石斛多糖含量的方法及采用该方法得到的铁皮石斛

权利要求书

1.一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)过表达DcUGP载体构建：

a.根据已知的铁皮石斛的DcUGP cDNA序列，设计引物；

b.提取铁皮石斛RNA反转录得到总cDNA，根据步骤(a)中设计得到的引物进行PCR扩增得到DcUGP目的片段；

c.用SpeI与AscI限制内切酶对载体pFGC1008与步骤(b)得到的DcUGP目的片段进行酶切；

d.将步骤(c)酶切后的DcUGP目的片段与载体pFGC1008进行电泳检测，对所需片段进行回收；将回收产物加入连接酶进行连接反应，得到连接产物pFGC1008-DcUGP；

e.将步骤(d)所得的连接产物pFGC1008-DcUGP转化大肠杆菌后，提取质粒pFGC1008-DcUGP并验证；

(2)pFGC1008-DcUGP转化农杆菌GV3101

将步骤(1)所得的质粒pFGC1008-DcUGP转化农杆菌GV3101，然后进行克隆PCR，进行农杆菌验证；

(3)菌种活化：

活化含有pFGC1008-DcUGP的保存农杆菌GV3011，制成侵染液；

(4)侵染：

选取生长健壮、颜色较绿且较致密的铁皮石斛野生型原球茎并切割，然后加入步骤(3)所得侵染液，进行侵染；

(5)共培养：

将步骤(4)侵染后的原球茎转入共培养基上进行共培养；

(6)抗性筛选：

将步骤(5)共培养后的原球茎转移至筛选培养基进行抗性筛选，至分化出新的原球茎，即完成抗性筛选；

(7)植株再生：

将步骤(6)所得的新的原球茎转移至不含潮霉素的培养基，待其分化出芽后，转入生根培养基中生根，获得完整植株。

2.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(3)中，农杆菌GV3011的活化方法为：将农杆菌GV3011用YEP培养液两次培养，培养后收集菌体用MS液体培养基制成侵染液。

3.根据权利要求2所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述YEP培养液的组成为：Gen 50μg/mL+Rif 10μg/mL+Cm 25μg/mL。

4.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(4)中，侵染前，对步骤(3)所得的侵染液进行浓度调整。

5.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述侵染的条件为28℃摇床50rpm侵染30min。

6.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(5)中，共培养条件为20℃下黑暗培养4d。

7.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述筛选培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+灭菌后加头孢500mg/L+潮霉素20mg/L。

8.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(6)中，筛选培养的条件为：22-25℃，光照强度为1800-2000Lx，光照周期为14h光照/d，10h黑暗/d的恒温培养室培养。

9.根据权利要求1所述的提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述生根培养基的配方为：MS+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+灭菌后加头孢500mg/L。

10.权利要求1-9任意一项所述的方法得到的铁皮石斛。