[发明专利]制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法

说明书

本发明公开了一种制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法。本发明提供了突变ROSA26基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。该方法通过向受体细胞中导入sgRNA和Cas9以及含有PPARγ基因表达盒的供体DNA实现ROSA26基因的定点整合。实验证明，利用本发明的方法可以成功于ROSA26基因位点定点整合PPARγ2基因，最终成功得到表达PPARγ2的动物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法。

背景技术

对世界上大多数国家而言，猪肉是动物蛋白的主要来源。随着猪肉品质越来越受到人们的关注，肉质改良已成为目前猪育种工作的重点。影响猪肉质性状的因素很多， 但肌内脂肪(IMF)含量目前被认为是最重要的肌肉品质性状指标之一，它与肉的嫩 度和风味有直接关系，是非常重要的经济性状。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activatedreceptors γ， PPARγ)是细胞核激素受体家族的一种活性配体转录蛋白，主要在脂肪组织、血管平滑 肌以及巨噬细胞中表达，其中脂肪组织表达最高，研究表明PPARγ在脂肪细胞分化和 成熟、脂肪酸的吸收储存以及脂肪沉积的关键因子。

大量研究表明在动物生产中，PPARγ是脂肪沉积和肉品质形成的重要影响因子，PPARG与动物肌内脂肪含量相关，是影响畜禽肌肉内脂肪含量的主效候选基因，猪 PPARγ基因编码1.8Kb mRNA，与人、牛和小鼠PPARγ具有高度同源性，相似性分别 为99％、97和96％。PPARγ表达量高的杜洛克猪肌内脂肪含量高于长白猪。因此PPARγ 是提高肌内脂肪含量的主要候选基因之一。猪PPARγ基因的多态性对肌肉内脂肪含量 影响显著，在mRNA水平对肌肉内脂肪含量影响显著。

CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑工具，最早发现于细菌中，是广泛存在于细菌和古细菌体内的一种获得性免疫系统。Cas9蛋白是一种由1409个氨基酸组成的 多结构域蛋白，有两个结构域，N端的RuvC结构域和位于蛋白中间的HNH核酸酶结 构域。HNH核酸酶结构域切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于原型间隔 序列毗邻基序(PAM)上游3nt处，RuvC对另一条链进行切割，切割位点位于PAM上 游3-8nt处，从而形成双链DNA断裂，生成一个DSB。改造后的Cas9系统主要由向 导RNA和Cas9蛋白组成，向导RNA由一段20bp大小的识别序列和一段可形成发卡 结构的重复序列组成。识别序列通过碱基互补，靶向到基因组相应的位置，重复序列 与Cas9蛋白形成复合体并发挥酶切作用，切断目标区域的双核苷酸链。双链断裂的 DNA激活细胞内的非同源末端连接修复机制(NHEJ)或同源重组修复机制(HDR)从 而实现基因的快速敲除和敲入。

目前，CRISPR/Cas9系统已经应用到细菌、斑马鱼、哺乳动物细胞中。2013年第 一头由CRISPR/cas9技术敲除DAZL和APC基因的克隆猪诞生。目前在猪上已成功 实现了利用CRISPR/Cas9技术进行抗病育种和提高瘦肉率等育种。2015年，中韩科学 家在利用CRISPR/Cas9技术将抑制肌肉发育的基因myostatin(MSTN)成功敲除，培 育出了“双肌猪”；2016年，美国科学家Prather教授带领的团队成功利用CRISPR/CAS9 技术将猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory Syndrome，PRRS)病 毒进入细胞的受体CD163敲除，病毒感染实验表明CD163敲除猪在感染病毒后35天 无任何临床症状，如发烧，呼吸困难，肺部异常等。这些成功的实例为我们利用 CRISPR/Cas9技术实现大家畜的新品种培育开阔了新的天地。

在基因敲入中，外源或内源基因的敲入位点，对于转基因安全十分重要，在这些位点的外源基因既要稳定高效表达，同时又要对细胞和组织无已知的副作用。