[发明专利]利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法

说明书

本发明公开一种利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，所述的单亚基RNA聚合酶，为来自KMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶，通过研究发现KP34RNA聚合酶在T7和Syn5转录系统的几个薄弱环节中显示出明显的优势，尤其是能产生精确均一的产物末端及对富含二级结构的RNA(如sgRNA)转录效果非常好。针对这一特性，利用该聚合酶合成的sgRNA末端均一性很高，提供了一个可以按需定制的DNA定点剪切工具，其效率高，成本低。

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法。

背景技术

SgRNA(single-guide RNA)是CRISPR基因编辑系统中重要的组成部分，早先发现的guide RNA由两部分组成—crRNA和tracRNA,两者“双剑合璧”后，即sgRNA能更方便也更稳定的行使定点导向的功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9蛋白靶向剪切目的基因。CRISPR是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式，是一套很巧妙的系统。它先把外来的DNA片段整合进细菌自己的基因组，然后转录出RNA，经过一些剪切后，并利用这些guide RNA把带有核酸内切酶活性的Cas蛋白直接引导到外源序列的位置，将外源DNA切断。对细菌或古细菌而言，就完成了对外来病原体的快速精准的打击。

至于最近很火的CRISPR技术其实是利用CRISPR系统中的RNA引导Cas蛋白去切断目标DNA的这一个步骤。当然CRISPR的爆火主要还是由于这套技术好用，是因为要达成基因敲除的目的，只需把两个质粒导入细胞即可大功告成。一个是含有Cas9蛋白的表达基因，它可以切断双链DNA。另一个是用来表达sgRNA,前一部分与目标基因配对，后一部分可形成发夹结构与Cas9蛋白结合，切断目标基因。这是传统构建CRISPR系统的方法。随着RNA研究的发展及RNA导入细胞方法的完善，目前也可以通过将Cas9 mRNA和sgRNA导入细胞而发挥基因编辑功能。RNA转运至细胞内就可以翻译成蛋白质或直接发挥作用后被迅速降解，与导入质粒法不同(DNA会一直存在细胞中)，这种方法不会造成基因突变的危险。

SgRNA的体外制备方法有化学合成和酶法合成这两种。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，目前化学合成RNA多限于短RNA(几个到几十个核苷酸长度)，且合成费用高。酶法合成RNA是在RNA聚合酶体外转录基础上建立的生物制备方法。相对于化学合成，酶法合成具有效率高、条件温和的特性，能够合成长序列RNA，更易于实现较大规模生产,是一种发展前景良好的RNA合成方法。目前体外酶法合成RNA主要是利用T7 RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，这使得T7 RNA聚合酶几乎成为了RNA酶法合成中唯一的工具酶。

T7 RNA聚合酶于四十年前被鉴定，其选择受限于当时已发现的有限噬菌体种类，无法保证它是一个最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺点包括：提前终止、延伸性能弱、产物末端不均一、必须以鸟苷酸起始、对修饰核苷酸掺入效率低、对富含高级结构的RNA转录效率低等等，以致很多情况下所需的RNA无法有效合成。因而选择T7作为体外合成RNA的标准酶具有很大的随机性。在随后的数十年中，人们对T7 RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，相关论文和专利不计其数，然而这个酶并不是天然为RNA体外合成而设，其主要缺点越来越成为RNA这一热门研究和应用领域的限制因素。