[发明专利]一种HEK293 gDNA残留量的检测方法

说明书

本发明提供一种HEK293 gDNA残留量的检测方法，包括样品前处理和HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测，所述样品前处理为基于磁珠的样品前处理方法，包括细胞裂解液和蛋白酶K对样品进行消化处理，加入异丙醇和磁珠对核酸进行抽提富集，洗涤两次以去除蛋白及其它污染，将核酸从磁珠上洗脱；所述HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测方法是以HEK293 gDNA作为模板，利用设计出的针对HEK293 gDNA具有特异性的引物和探针进行定量检测，所述定量PCR为基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术，本发明具有高效、快速、准确、特异性强的优点。

技术领域

本发明提供一种HEK293 gDNA残留量的检测方法，包括样品前处理及HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测，属于生物制品质量控制中残留杂质检测领域。

背景技术

HEK293细胞即人胚胎肾细胞293(ATCC CRL-1573)，其具有转染效率高、可悬浮培养的特点，且HEK293细胞在培养体系中能够快速增长，实现高密度培养用于大规模表达，因此被广泛的用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。用传代的细胞株进行疫苗生产的一个最重要的问题就是宿主细胞DNA片段的残余。虽然经过严格的纯化工艺，但是产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些残余DNA可能带来传染性或致瘤性风险。由于残余DNA的潜在致病风险性，许多机构对生物制品中DNA的残留量制定了相关标准。WHO和欧盟规定每人份的生物制剂产品中DNA的残留量需控制在10ng以下；美国FDA则规定每人份生物制剂产品中DNA的残留量在100pg以内。

残留DNA属于微量杂质，对其进行快速、高效、准确的检测是一项艰难的工作。2015版《中国药典》第三部对于外援性DNA残留的检测方法只收录了DNA探针杂交法和荧光染色法。DNA探针杂交法是利用地高辛标记HEK293细胞DNA以制备成DNA杂交探针，然后利用此探针与待测样品总DNA以及相应已知浓度的参比DNA进行杂交，最后通过显色信号从而判断样品中残留DNA的含量。虽然DNA探针杂交法条件相对简单，但是该方法具有操作繁琐、稳定性、敏感性和特异性差的缺点。荧光染色法则是利用双链DNA荧光染料与双链DNA特异性结合形成复合物，从而测定残留DNA的含量。当DNA残留量在1.25-80ng/ml范围时，荧光染色法线性较好。该方法的缺点为易受ssDNA、dsDNA干扰，同时其灵敏度和特异性难以达到检测要求。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提供一种HEK293 gDNA残留量的检测方法，包括样品前处理和HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测，具有高效、快速、准确、特异性强的优点。

利用QIAGEN DNeasy BloodTissue Kit对HEK293细胞进行gDNA(基因组DNA)抽提纯化，将抽提好的HEK293gDNA，利用琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测后进行分装，存放于-80℃冰箱以用于后续的实验。

一方面，本发明提供一种样品前处理的方法，样品前处理为基于磁珠的样品前处理方法。

所述样品的前处理包括：(1)利用细胞裂解液和蛋白酶K对样品进行消化处理，(2)加入异丙醇和磁珠对核酸进行抽提富集，(3)洗涤两次以去除蛋白及其它污染，(4)将核酸从磁珠上洗脱以用于后续定量检测。

优选地，细胞裂解液的组成成分为：6M异硫氰酸胍、1M DTT、0.5M醋酸钠、2％N-月桂酰肌氨酸钠、50mM EDTA和0.6M Tris-HCl。

另一方面，本发明提供一种HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测方法，包括针对HEK293 gDNA的特异性引物及探针的设计和进行荧光定量PCR检测。