[发明专利]用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂

说明书

本发明公开了一种用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂，所述方法包括：以核酸作为起始模板材料进行第一次扩增，其中正向引物由5’端至3’端依次包括公共序列、唯一分子识别标记序列以及与模板结合的序列，反向引物是目标特异性序列或非特异性序列；以第一次扩增的产物为模板进行第二次扩增，包括在各自独立体系中进行的正向文库扩增和反向文库扩增；以及以第二次扩增的产物为模板进行第三次扩增。本发明的方法将唯一分子识别标记技术与定向加正反测序接头形成正反双向文库技术结合起来，根据测序重叠部分拼接出高质量的数据，从而实现长读长测序。本发明对多种平台具有广泛的适用性，适用于单端测序和双端测序策略。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及一种用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂。

背景技术

长PCR产物文库的高通量测序，如16S rRNA细菌鉴定、基于高通量测序的HLA分型以及免疫组库测序等，在科学研究中经常遇到。以免疫组库可变区全长文库(主峰300bp至600bp)为例，一般采用Illumina公司的PE250(Hiseq)或者PE300(Miseq)测序方式。所使用的进口测序仪器和测序试剂价格都很昂贵，购买货期较长，并且保质期较短。同时，对于PCR产物的双末端高通量测序策略而言，PE250或者PE300测序模式下的读长2(Reads2)的末端100bp质量值迅速下降(Q30从70-80％以上下降至50％以下)。而国产测序仪目前还不能做到对主峰300bp至600bp插入片段序列的高质量测序。对单末端测序来讲，能保证前300bp碱基的高质量值，Q30大于等于70％～80％，大于300bp时碱基质量值迅速下降。但是国产测序仪器和试剂价格相对便宜，货期短，因此若能开发出基于国产测序仪的长PCR产物的建库和测序策略，将具有很大竞争优势。

发明内容

本发明一种用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸文库的构建方法，该方法包括：

(a)以DNA或RNA作为起始模板材料进行第一次扩增，上述第一次扩增中使用的引物包括正向引物和反向引物，其中上述正向引物由5’端至3’端依次包括一段公共序列、一段唯一分子识别标记序列以及一段与模板结合的序列，上述反向引物是目标特异性序列或非特异性序列；

(b)以上述第一次扩增的产物为模板，进行第二次扩增，上述第二次扩增包括在各自独立体系中进行的正向文库扩增和反向文库扩增，上述正向文库扩增中使用的引物包括第一引物和第二引物，上述第一引物由5’端至3’端依次包括部分测序接头序列A和上述公共序列，上述第二引物由5’端至3’端依次包括部分测序接头序列B和目标特异性序列；上述反向文库扩增中使用的引物包括第三引物和第四引物，上述第三引物由5’端至3’端依次包括上述部分测序接头序列B和上述公共序列，上述第四引物由5’端至3’端依次包括上述部分测序接头序列A和上述目标特异性序列；以及

(c)以上述正向文库扩增和反向文库扩增的产物为模板，进行第三次扩增，上述第三次扩增中使用的引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物包括位于3’端的上述部分测序接头序列A及其上游序列，该上游序列包括用于区分样本的条形码序列，上述反向引物包括位于3’端的上述部分测序接头序列B及其上游序列。

优选地，上述起始模板材料是DNA，上述第一次扩增使用的正向引物中与模板结合的序列是一段特异性序列，上述第一次扩增使用的反向引物是目标特异性序列。

优选地，上述起始模板材料是RNA，上述第一次扩增使用的正向引物是模板转换寡核苷酸(TSO)，上述模板转换寡核苷酸中与模板结合的序列包括位于3’端的锁核酸(LNA)，上述第一次扩增使用的反向引物是随机引物或oligo-dT引物。