[发明专利]一种基于荧光编码微球的EGFR突变基因检测方法

说明书

本发明公开了一种基于荧光编码微球的EGFR突变基因检测方法，涉及EGFR突变基因的检测。本发明提出了一种基于荧光编码微球的EGFR突变基因检测方法，该方法先将多种针对EGFR突变基因的特异性检测探针分别固定在不同的荧光编码微球上，然后通过modified ARMS‑PCR扩增待检样品中含有突变基因的片段，最后将扩增后的片段与表面固定了特定检测探针的多种编码微球进行杂交，并通过流式细胞术或者荧光成像技术达到判断待检样品中是否含有特定EGFR突变位点的目的。本发明同时还提出了一种用于检测EGFR突变基因的试剂盒。本发明具有灵敏度高、准确性高、特异性强，能同时检测出多种EGFR突变基因的优点。

技术领域

本发明涉及癌症患者EGFR突变基因检测领域，尤其涉及一种基于荧光编码微球的EGFR突变基因检测方法。

背景技术

人类表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面， 具有酪氨酸激酶活性。EGFR是HER/ErbB家族成员之一。EGFR与其配体结合后 在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，经过细胞 质中的衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、 增值、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或配体过表达，从而通过自 分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增值。此外，EGFR过度活化还可以启动多 种蛋白水解和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表 达者通常预后较差。

易瑞沙和特罗凯作为EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂，是美国FDA批准用于 NSCLC靶向治疗的主要药物。但是临床实验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的 NSCLC病人有显著的疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治 疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患者疗效显著。肺癌细胞中有EGFR酪 氨酸激酶基因编码区18-21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达 80％。如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅会耽误病情还会 造成巨额的药疗资源的浪费。因此，检测组织或血液中是否含有EGFR基因突变 对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的参考价值，也是未来肿瘤个体化治疗 的发展方向。

然而EGFR突变为体细胞突变，在肿瘤患者中突变的频率较高(美国NSCLC 患者中约10％有EGFR基因突变，而亚洲人群这一比例约为30％)。但是突变基 因与未发生突变的野生型基因相比，突变比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比 例通常为0.01％～10％。因此针对EGFR突变基因的检测最大的难题是如何在大量 野生型基因背景下检测出极少量发生突变的EGFR基因。另外，由于已知可以靶 向治疗有关的EGFR突变类型高达40多种，因此如何实现单次有效检测40多种 突变基因类型也是EGFR检测技术的另一项挑战。目前检测基因突变的方法主要 包括：直接测序法、传统的荧光定量PCR法、高分辨率溶解曲线法和探针扩增阻 滞突变法(amplification refractory mutation system,ARMS)。测序法耗时长且灵敏 度低，通常对含量超过5％的基因突变进行检测。因此该方法不适合应用于临床样 本的分析。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到 专一性的扩增，容易出现假阳性的检测结果；同时检测的位点数量和检测样本的 通量都相对比较小。高分辨率溶解曲线法检测敏感性在5％左右，且所使用的仪器 与相应配套的软件比较特殊，同时检测结果稳定性不佳，难以在医院进行普及。 ARMS-PCR是利用PCR引物的3’末端碱基必须与模板互补才能有效扩增的原理， 通过设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，进而达到检测突变基因的目的。 虽然ARMS-PCR方法是一种较为简单、且灵敏度较高的检测方法，但是受限于PCR 检测通道，难以实现对多种EGFR突变基因进行同时检测。