[发明专利]间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基

权利要求书

1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNase I溶液；

将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；

洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；

分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述DNase I溶液的中DNase I的浓度是18000U/ml～23000U/ml。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。

5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，所述血清替代物是UltraGRO^TM血清替代物。

6.如权利要求1～5中任一项所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：

分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于添加有无血清培养基的容器中进行原代培养；

待原代培养的容器中细胞融合度达到75％～85％时，使用无胰酶的消化液消化细胞，离心去上清后，接种于多层细胞培养器中进行传代扩大培养。

7.如权利要求6所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，在原代培养时，所述干细胞的单细胞沉淀是按照(4.5～5.5)×10³个细胞/cm²的接种密度接种，所述未完全消化的组织块是按照每75cm²的接种培养面积添加0.15～0.25g组织块的接种密度接种；

在所述多层细胞培养器中进行扩大培养时，是将原代培养细胞按照(4.5～5.5)×10³个细胞/cm²的接种密度接种。

8.一种间充质干细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：向如权利要求1～7中任一项所述的间充质干细胞的分离培养方法分离培养得到的间充质干细胞的传代培养细胞中添加冻存保护剂，进行液氮冷冻存储；

所述冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：10～12份的DMSO、0.5～1.5份的右旋糖酐-40、7～9份的注射用水、30～40份的无血清基础培养基、40～50份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。

9.如权利要求8所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述传代培养细胞是第5代的传代培养细胞。

10.一种无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。