[发明专利]一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法

说明书

本发明提供一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法，涉及GO生物学效应技术领域。具体包括PBS和MTT溶液的制备、GO分散液的制备、免疫细胞的培养、GO分散液的摄入和免疫细胞的处理跟踪实验等步骤，其中免疫细胞的处理跟踪实验包括细胞生长状况的测定、增值率的测定和细胞微丝骨架蛋白含量的测定等步骤。本发明通过摄有GO的免疫细胞在不同时间内进行培养，从而在体外模拟GO的生物安全性，根据多项数据测定出GO对细胞的生物学效应，并且通过排除其他外界因素对实验结果的干扰和影响，使得测定结果准确度高，可靠性强。

技术领域

本发明涉及GO生物学效应技术领域，具体涉及一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法。

背景技术

氧化石墨烯(GO)是石墨烯经过氧化后得到的。GO是一个非常有前途的纳米材料，具有广泛的生物医学应用，但是由于GO会产生细胞毒性，因此具有潜在的不利影响。近几年已有研究表明，GO对水生和陆生生态系统具有毒害效应。GO能够通过胞外覆盖、胞内氧化胁迫或直接破坏细胞膜等方式对细胞产生危害，而且即使在低浓度无明显毒性的情况下，GO也可以与其他物质形成复合物进而对生物产生毒害效应。这无不表明GO对细胞已表现出明显的生物学效应。

目前还没有具体的方法测定GO通过免疫细胞对生物产生的影响，因此对于GO引发的不利影响的分子基础尚不清楚，也无法确定生物体内GO的安全使用剂量，为此我们提出一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法，本发明通过摄有GO的免疫细胞在不同时间内进行培养，从而在体外模拟GO的生物安全性，根据多项数据测定出GO对细胞的生物学效应，并且通过排除其他外界因素对实验结果的干扰和影响，使得测定结果准确度高，可靠性强。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法，包括以下步骤：

(1)制备两个PBS溶液，将粉状MTT溶于其中一个PBS溶液中，抽滤灭菌得MTT试剂备用；

(2)将GO放入真空干燥箱中进行干燥，干燥后将GO分散在二次水中并进行超声分散，分散后再将其进行不等量分装，再分别加入二次水得到不同浓度的GO分散液备用；

(3)将上述步骤(2)中的不同浓度的GO分散液倒入24孔板内，然后将免疫细胞接种到24孔板中的GO分散液内，再将孔板放在培养箱中开放培养不同时间后分别吸去培养液，并倒在显微镜下观察细胞的形态；

(4)通过MTT溶液对免疫细胞继续进行培养，培养处理后测定每孔的吸光度值，取平均值后将吸光度值转换成细胞相对增值率，然后将各组的细胞相对增值率转换成细胞毒性级别；

(5)用胰酶消化免疫细胞，吹打后得到单细胞悬液，在培养皿中制作免疫细胞爬片，再放入细胞培养箱中培养，培养并处理后加入FITC标记的鬼笔环肽稀释液进行反应，再用DAPI对免疫细胞进行染色，再用抗淬灭封片剂进行封片，从而完成免疫细胞微丝骨架结构标记实验。

优选的，步骤(4)中的免疫细胞处理包括吸去原培养液、PBS清洗、弃除余液和二甲基亚砜溶解结晶物等操作。

优选的，步骤(4)中的细胞毒性试验采用5分制法进行细胞毒性分级，细胞相对增值率(％)＝实验组平均吸光度值×100％/对照组平均吸光度值，细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系：细胞相对增值率(％)≥100％细胞毒性为0级，细胞相对增值率(％)为75％～99％，细胞毒性为1级；细胞相对增值率(％)为50％～74％，细胞毒性为2级；细胞相对增值率(％)为25％～49％，细胞毒性为3级；细胞相对增值率(％)为1％～24％，细胞毒性为4级；细胞相对增值率(％)为0％时，细胞毒性为5级，0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显细胞毒性。