[发明专利]一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用，该突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、323位、344位、449位和510位氨基酸进行单点突变或多点突变获得的。与野生型苏氨酸脱氨酶相比，本发明苏氨酸脱氨酶具有极高的稳定性，可以大大提高工业化生产中苏氨酸脱氨酶的使用寿命。其中，G323D/F510L/T344A突变体应用于L‑2‑氨基丁酸的生产，可以使L‑苏氨酸转化率达到99％，NAD⁺添加量降为0.04g/L，这为L‑2‑氨基丁酸的大规模生产提供了良好的技术支持。

技术领域

本发明涉及苏氨酸脱氨酶突变体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。

背景技术

苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase，简称TD，EC 4.3.1.19)，催化L-苏氨酸脱氨生成α-酮丁酸，是异亮氨酸合成代谢途径的关键步骤。α-酮丁酸是生产L-2-氨基丁酸、异亮氨酸、D-2-羟基丁酸以及正丙醇的重要原材料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为治疗癫痫的手性药物左乙拉西坦和布瓦西坦，抗结核药物盐酸乙胺丁醇，以及内皮素抗因子、连氮丝菌素类抗生素的重要前体，受到广泛的关注。

目前，已经有苏氨酸脱氨酶应用于L-2-氨基丁酸合成的报道，但其稳定性较差，限制了生物催化剂的使用寿命，限制了催化效率，也增加了工业生产中的成本。因此，提高苏氨酸脱氨酶的热稳定性，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在L-2-氨基丁酸的制备中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种苏氨酸脱氨酶突变体、编码基因、重组载体、基因工程菌以及在催化L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种苏氨酸脱氨酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第14位、323位、344位、449位和510位进行单、双、三或四点突变而成。

进一步，所述单突变是将第14位丙氨酸突为苏氨酸(A14T)、第323位甘氨酸突变为天冬氨酸(G323D)、第344位苏氨酸突变为丙氨酸(T344A)、第449位精氨酸突变为半胱氨酸(R449C)、第510位脯氨酸突变为亮氨酸(F510L)；所述双点突变为A14T/G323D、G323D/T344A、G323D/R449C、G323D/F510L；所述三点突变为G323D/F510L/T344A、G323D/F510L/R449C；所述四点突变为G323D/F510L/T344A/R449C。

更进一步，所述突变体氨基酸序列为下列之一：SEQ ID.2，SEQ ID.3，SEQ ID.4，SEQ ID.5，SEQ ID.6，SEQ ID.7，SEQ ID.8，SEQ ID.9，SEQ ID.10，SEQ ID.11，SEQ ID.12和SEQ ID.13。

本发明还涉及一种编码所述苏氨酸脱氨酶突变体的基因。

本发明还涉及一种携带所述基因的重组载体。

本发明还涉及一种由所述重组载体转化制备的重组工程菌。

本发明提供一种所述苏氨酸脱氨酶突变体在催化L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸中的应用。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明构建了一种高效表达苏氨酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌，提高了苏氨酸脱氨酶的热稳定性；该菌株可以用于L-2-氨基丁酸的生产，使脱氢酶法合成L-2-氨基丁酸的转化率达到99％以上，且NAD⁺的添加量低至0.04g/L，有利于实现脱氢酶法生产L-2-氨基丁酸的工业化。

附图说明