[发明专利]一种用于检测鱼源创伤弧菌金属蛋白酶基因的引物以及荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明提供了一种用于检测鱼源创伤弧菌金属蛋白酶基因的引物以及荧光定量PCR检测方法，所述引物的核苷酸序列如下所示：上游引物VVPF：CCTGGTTTCTCGGGTGCTG；下游引物VVPR：TGGTATGCCGTTGACTCTTTGA。本发明所述的用于检测鱼源创伤弧菌金属蛋白酶基因的引物以及荧光定量PCR检测方法为创伤弧菌感染的早期检测与快速鉴定、组织亲嗜性研究、流行病学调查等方面，提供一种特异、敏感和成本较低的检测方法。为鱼源创伤弧菌感染的早期诊断、快速鉴定及临床应用奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种用于检测鱼源创伤弧菌金属蛋白酶基因的引物以及荧光定量PCR检测方法。

背景技术

创伤弧菌的毒力因子有溶细胞毒素、金属蛋白酶、荚膜多糖、鞭毛及 RTX毒素，与菌体致病性密切相关。许多学者已经对它们的致病机制进行了广泛的研究(Oliver etal.1986)。在已有报道中，各毒力因子在创伤弧菌感染过程中发挥重要作用，通过不同的途径发挥其致病作用，对宿主造成损害 (武静等2015；王明义和胡成进2017)。

一直以来，创伤弧菌在水产养殖行业的报道很多，有过报道的动物有皱纹盘鲍(马健民等1996)、石鲽鱼(沈志强等2001)、军曹鱼(简纪常等 2003)、大菱鲆(于兰萍等2008)和矛尾复虾虎鱼(马爱敏等2008)、黄姑鱼(毕可然2011)、罗非鱼(黎炯等2011)和矛尾复虾虎鱼(毕可然等 2011)等。创伤弧菌病表现症状因品种不同而不同，无典型病理变化，因此给临床诊断造成了很多的困扰。创伤弧菌对水产养殖业危害严重，造成了较大的经济损失，已经受到了广大水产疾病研究者的特殊关注与重视。

金属蛋白酶(Metalloprotease)即VVP，是菌株唯一分泌至细胞外的蛋白酶，是一种较强的毒力因子(FAN et al.2011)。对人体内的大部分蛋白质具有广泛的蛋白酶活性，能分解胶原蛋白和弹性蛋白(Miyoshi et al.1995) 进而导致组织坏死以及皮肤损害，可激活血浆中的缓激肽进而引起血管通透性增强，出现局部水肿或大疱。缓激肽的生产也是创伤弧菌感染后机体的重要特征性表现之一(Wang et al.2008)。

水产病原菌分离鉴定主要采用传统的生理生化鉴定法，分子生物学方法和免疫学方法进行检测。其中生理生化鉴定法配合分子生物学方法仍是重要的致病弧菌检测手段。血清学检测是采用特异性抗体与抗原发生血清学反应，以确定病原菌的种类。间接荧光抗体的技术(秦启伟等1995)和双抗夹心ELISA检测法(王崇明等1999)这两种方法都是免疫学为基础的血清学检测法在创伤弧菌检测的实际应用，检测灵敏度高，最低细菌检测数为 1×10⁴CFU/mL。但以上方法程序复杂，耗时费工。

近几年水产品检疫中，TaqMan探针法已经得到了广泛的应用，创伤弧菌vvhA基因序列设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，潘军航等 (2010)已经建立了检测创伤弧菌TaqMan探针法，灵敏度达1.4CFU/mL。但前期工作复杂，需要设计特异性的TaqMan探针，价格昂贵。

实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，RT-PCR /q-PCR)是一种新的核酸定量技术。程晓艳等(2010)利用该染料已经建立 qPCR检测对虾白斑综合症病毒方法，并且对试验结果的特异性进行了专门的阐述。但对鱼源创伤弧菌金属蛋白酶基因，q-PCR技术尚未见相关应用。