[发明专利]一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法

说明书

本发明涉及一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法，所述引物序列为CytbMOSF:TTTCAGCTYGATGAAATTTTGG；CytbMOSR:TATAAAACWGTTAAAATTTG，所述方法包括步骤1：提取待测样本模板DNA；步骤2：对步骤1中提取的待测样本的模板DNA进行PCR扩增；步骤3：将步骤2中PCR扩增产物进行电泳确定；步骤4：对步骤3中确定后的PCR产物进行DNA序列测定。利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，采用相应测序方法，快速准确得扩增出基因序列，为后续Cytb基因进行病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源提供基础。

技术领域

本发明涉及本专利涉及基因工程及分子生物学领域，尤其涉及国境口岸或国内卫生安全领域的病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源。

背景技术

随着自然条件的变化以及国际交通、贸易和旅游业的发展，生物入侵(包括病媒生物入侵)日益成为一个严重的国际生态和卫生安全问题。生物多样性公约组织报告显示，生物入侵给世界各国造成了重大的经济损失。其中，美国每年损失1370亿美元；印度1170亿美元；巴西500亿美元；南非70亿美元。

病媒生物作为入侵物种的特有一种，因其可能携带人类易感病原体而备受国际社会关注。越来越多的病媒生物可随交通工具、集装箱、货物等被有意或无意地带至新的区域，其中的许多物种与本地物种竞争营养、水分和生存空间而在其传入地建立种群并大量繁殖、扩散，排挤本地物种，破坏生态平衡。占据优势的外来病媒生物不仅使得相关传染病病爆发、流行的潜在风险加大，而且有新发传染病出现的可能。历史上多次发生由病媒生物的入侵造成疾病的爆发流行的事例。如1930年，冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)随邮船从西非的塞内加尔输入到巴西，并在巴西东北部大量孳生繁殖，导致巴西1939～1940年的疟疾流行。近30余年来，西欧已经发生63起“航空港疟疾”事件，均为飞机将感染疟原虫的媒介按蚊输入，并传播给当地居民。1975年，1名罗斯河病毒携带者到达斐济，在机场被蚊叮咬导致该病传播，引起斐济全岛罗斯河病毒大流行。1998年，一艘汽船将染有鼠疫杆菌的褐家鼠从印度带到马达加斯岛，鼠疫在该岛开始出现。2000年，埃及伊蚊在位于太平洋的复活节岛被发现，两年后，该岛暴发流行登革热，发病率达16.6％。而近年来，全球相继出现了登革热、黄热病、寨卡病毒病爆发，这些疾病的传播途径均为病媒生物蚊科昆虫。

为此，国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)已将“危险传播媒介鉴别与防治技术、生物入侵防控技术”研究列入国家公共安全研究的优先发展主题。

研究表明，当外来蚊种进入一个过去不曾分布的区域，并能存活、繁殖、形成野化种群，其种群进一步扩散已经或将造成明显的环境、健康、经济后果，这一过程成为入侵。一般将入侵的过程分为传入、定殖、扩散三个阶段，或更细分为传入期、归化期、促进期、停滞期、与本地生物互动期和稳定期等。输入性蚊类的确定有助于防止外来新种的定殖、扩散、成为优势蚊种，向评估本底蚊种群构成是否处于平衡状态提供科学依据。更为重要的是，识别输入性蚊类是遏制传染病输入、爆发、流行的第一道防线。

本研究以山东口岸及周边地区的蚊为代表，应用mtDNA Cytb基因研究其遗传多样性及系统发育，并以该数据作为本底值，借助MEGA等软件构件系统发育树，测量疑似输入个体与本底值之间的遗传差距，用以蚊科遗传多样性分析及输入性蚊种的确认，为防止传染病的输入、爆发、流行提供有力的技术支撑，为保障口岸卫生安全提供坚实的科学依据。

线粒体DNA基因组具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点，比核DNA更容易检测，亲缘关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。目前，常用的mtDNA分子标记有很多，包括：Cytb基因、12SrRNA基因、16SrRNA基因、D-loop控制区、ND基因和CO基因。其中，Cytb基因由于其独具的优势而被广泛地研究应用。