[发明专利]一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法

权利要求书

1.一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其包括如下步骤：矿化液的准备、三维微球的制备、细胞微球的矿化以及材料补充手段，其特征在于：所述矿化液的准备实施方式为将4.2mM的K2HPO4加入完全培养基形成矿化培养基A,将9mM的CaCl2和0.2mg/ml的聚天冬氨酸加入完全培养基中形成矿化培养基B；所述三维微球制备实施方式为将大鼠来源骨髓间充质干细胞(P3)接种于三维培养板中；所述细胞微球的矿化实施方式为：将三维培养板中的微球放置于矿化培养基进行培养；所述材料补充手段实施方式为采用扫描电镜(SEM)和能谱分析仪(EDX)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分、采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能、微球内细胞活性的检测、微球内细胞分布的检测以及通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力。

2.根据权利要求1所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其特征在于：所述完全培养基由如下成分配置：20％牛血清,100U/ml青霉素/链霉素,2mM谷氨酰胺,α-MEM培养基,55μM的2-甲氧基雌二醇以及55μM的地塞米松磷酸钠，所述α-MEM培养基为本领域技术人员公认常识培养基。

3.根据权利要求1所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其特征在于：所述三维微球的制备具体实施方式为：接种于三维培养板中的大鼠来源骨髓间充质干细胞(P3),于37℃,浓度为5％的CO₂的敷箱中完全培养基培养24h后得到微球形态的细胞团块(CS)；所述细胞微球的矿化具体实施方式为：所述矿化培养基由矿化培养基A与矿化培养基B 1:1混合制成,所述混合溶液中Ca²⁺浓度为4.5mM,PO4^3-浓度为2.1mM，混合后的矿化培养基培养细胞培养板中的微球,24h后得到矿化细胞外基质干细胞微球(MECS)；所述采用扫描电镜(SEM)和能谱分析仪(EDX)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分具体实施方式为：将培养5天后的不同细胞微球经3.7％多聚甲醛固定后,经梯度酒精脱水(50％－100％)，喷金后，在15kV电压下观察；所述采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能具体实施方式为：在室内常规环境下的测量中，采用Derjaguin–Muller–Toporov(DMT)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量，每组选用2个样本，每个样本选择3个图，每个图中选5个点，这样每组共30个数据，并采用Anova方差分析。

4.根据权利要求1所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其特征在于：所述微球内细胞活性的检测具体实施方式为：加入5ul室温平衡后的16mMPI储存液至10ml PBS中，涡旋震荡混匀，得到8uM的PI溶液；将5ul 4uM的钙黄素AM储液加入到10ml的PI溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀，所得到溶液(2uM钙黄素AM和8uM PI)，直接染色细胞,观察微球内细胞的活性；所述微球内细胞分布的检测具体实施方式为：收集后的细胞微球,经Triton-X破膜,羊血清封闭后,孵育鬼笔环肽,并用含4’，6-二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)的封片剂封片，镜下观察。

5.根据权利要求1所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其特征在于：所述通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力具体实施方式为：用PBS洗三遍后,提取经过成骨诱导和未经成骨诱导两种微球的RNA,通过PCR计算分析成骨相关基因ALP、BMP-2的表达情况。

6.根据权利要求1-5所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，为了验证该方法所制得的矿化细胞外基质细胞微球的生物学功能性，设计了颅骨缺损修复实施方案，其包括以下步骤：

1)按照缺损区域准备材料β-TCP和两种微球；

2)将收集的CS、MECS与β-TCP和空白对照分别植入缺损区，明胶海绵覆盖，缝合；

3)8周后处死，micro-CT与组织学检查缺损区成骨情况；

4)用HE、Masson染色、免疫荧光染色观察。