[发明专利]定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法

说明书

本发明公开了一种定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法：在甲醇中加入齐墩果酸标准品并稀释成系列浓度的对照品标准液；对照品标准液中加入白术内酯II标准品作为内标液A，在内标液A中加入不含齐墩果酸的梅花鹿血清处理后进行高效液相色谱分析；以齐墩果酸的质量浓度为横坐标，以齐墩果酸与白术内酯II峰面积比值作为纵坐标，绘制标准曲线；在内标液B中加入待测梅花鹿血清经处理后进行高效液相色谱分析，将待测梅花鹿血清中齐墩果酸与白术内酯II峰面积比值代入所述标准曲线中，得到梅花鹿血清中齐墩果酸的质量浓度。采用该方法检测齐墩果酸具有准确性高的优点。

技术领域

本发明涉及一种野生华南梅花鹿血液中齐墩果酸的定量检测方法。

背景技术

齐墩果酸，属于α-香树脂醇型五环三萜类化合物，相对分子量为456，分子式为C30H48O3，化学结构式如式1所示。齐墩果酸在自然界中分布非常广泛，根据中药化学方面的资源调查和分析，目前齐墩果酸至少存在于26个科70多种天然植物中，如灯台树、夏枯草、陆英、车前草、白花蛇舌草、柿蒂、乌梅、女贞子等中草药、乔木中均广泛被检测出。现代中药药理学研究表明，齐墩果酸具有广泛的药理作用和重要的生物活性，尤其表现在抗炎、保肝护肝、抗肿瘤以及调节机体免疫力等方面已经呈现出令人关注的药理特性，其临床应用前景十分诱人。

式1、齐墩果酸结构式

梅花鹿(Cervus nippon)属哺乳纲偶蹄目鹿科动物，是东亚季风区特产的珍贵经济动物，被国际自然和自然资源保护联盟列为濒危动物，属于我国I级保护动物。我国是野生梅花鹿的主要产区，现有四川亚种(C.n.sichuanicus)和华南亚种(C.n.kopscli)，至于东北亚种(C.n. hortulorum)的野生种群尚有待确证。梅花鹿华南亚种目前主要有两大种群：(1)是位于浙江省临安市境内的清凉峰自然保护区与安徽宁国万家乡交界地区的梅花鹿种群；(2)是位于江西省东北部彭泽县桃红岭自然保护区内的梅花鹿种群。其中浙江省临安市境内的清凉峰自然保护区作为我省一个最大的梅花鹿自然保护区，对于我国华南梅花鹿这一野生濒危物种的研究与保护提供了完整的自然生境和一定数量的种群基础。目前，国内人工养殖梅花鹿也很普及，研究表明肠道寄生虫是影响梅花鹿发展的重要疾病，梅花鹿尤其是幼龄梅花鹿感染肠道寄生虫会导致机体健康衰退、生产性能下降，甚至导致死亡。目前国内大部分梅花鹿养殖场均检查出寄生虫感染。

近年来，哈佛大学的研究人员理查德—兰厄姆在非洲坦桑尼亚研究黑猩猩时发现，黑猩猩有时候会到一个特殊的地方，在那里找到一种向日葵，将它的嫩叶吞咽下肚，但它们从不将这当作正餐吃。研究表明，这种向日葵的叶子里含有一种红色油状物质，能杀死动物肠道内的寄生虫和真菌，甚至能杀死与艾滋病有关病毒。美国威斯康星大学的卡伦—斯特里厄研究了生活在巴西的一种类人猿。他发现，类人猿甚至可以用挑选的草药来控制生育。如雌猿想怀孕了，它们就会到自己通常活动的范围之外，去采食一种叫猴耳树的果子，这种果子含有一种类似雌激素黄体酮的化学物质，吃过这种果子之后，雌猿就比较容易受孕。而在产下小猿之后，某些雌猿便有目的地大量吃含有植物性雌激素的豆子，以起到避孕的作用。

最近两年研究人员发现，梅花鹿在食物丰富的季节也经常啃噬或采食一些药用植物，根据中医药研究发现这些植物含有齐墩果酸、熊果酸等抗炎活性成分，以此来达到治疗或缓解寄生虫所致的梅花鹿肠道炎症。因此，准确定量检测梅花鹿血液中齐墩果酸等天然活性成分的浓度，对于探索梅花鹿在感染寄生虫后的“自我医疗”现象具有重要意义，同时对于探索野生梅花鹿保护措施和方法具有深远影响。

现有的检测齐墩果酸的方法——高效液相色谱法，其具有测试相对简便、快速和准确的特点，但目前文献报道的大多采用外标法来进行定量检测，而且也主要是测定中药材或者中药制剂中齐墩果酸含量，鲜见有检测野生动物组织中齐墩果酸含量的报道，且利用上述现有方法测定动物血液中齐墩果酸的含量，存在着以下不足之处：

1、文献报道的检测，其基质(原料药或制剂基质)较干净，杂质少，易于分离；而本研究为生物样品——梅花鹿血液中齐墩果酸检测，基质更加复杂。