[发明专利]一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法和应用，所述细胞模型为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并且保藏号为CGMCC NO.16201的细胞或其后代细胞。本发明还提供上述稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型在AQP2蛋白研究，抗体的临床前药效药性评估或药物筛选等方面的应用。本发明采用合适的扩增引物和鉴定引物构建质粒AQP2‑DYK，经其转染后的小鼠足细胞通过G418筛选和阳性克隆筛选后构建的细胞模型，不仅能够稳定、高效表达AQP2蛋白，而且构建快捷、成本低。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法和应用。

背景技术

目前已有研究证明，遗传性尿崩症有一种遗传类型为常染色体遗传，由Aquporin2(AQP2)的基因突变所致，突变位点1731A>C。因而，从理论上讲，建立人源化AQP2蛋白高表达细胞模型是可行的。通常来说，我们都通过人源化的动物来验证单克隆抗体或者其他特异性靶向人源分子的药物的药效以及其他相关药性评估，其中，人源化的小鼠为常用的实验动物，而且主要通过转基因的方法来实现。这一类方法在临床前的药性评估过程中发生着非常重要的作用，但是也存在着诸多不足，首要的一点就是建立稳定、高效表达目标蛋白的人源化小鼠细胞模型不仅耗时长而且费用也相对较高。因此，构建快捷成本低，用于相关蛋白研究、抗体的临床前药效药性评估的稳定、高表达AQP2蛋白的人源化细胞模型非常必要，也具有相当高的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法以解决现有技术中的问题，不仅能够稳定、高效表达AQP2蛋白，而且构建快捷、成本低。

为实现上述目的，本发明实施例的技术方案如下：

本发明实施例提供一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型，所述细胞模型为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并且保藏号为CGMCC NO.：16201的细胞或其后代细胞。

本发明实施例中所述细胞模型的分类命名为小鼠足细胞AQP2细胞株，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月19日，保藏编号为CGMCC NO.：16201。

本发明实施例中所述的稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型的构建方法，所述方法包括步骤如下：

I、构建AQP2-DYK载体，具体包括如下步骤：

(1)以人的cDNA为模板，以SEQ ID No:1(也可称为A1F)和SEQ ID No:2(也可称为A1R)所示的引物扩增，通过PCR扩增引入两个限制性内切酶切位点HindIII，获得SEQ IDNo:3所示的目的AQP2片段的扩增产物，将所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的AQP2片段；

(2)将回收的目的AQP2片段与质粒PUC19连接，用引物鉴定有效后，经碱性裂解法提取质粒DNA，获得具有目的AQP2片段的质粒PUC19-hAQP2；

(3)再用两个限制性内切酶HindIII和Kpn1酶切，将所述质粒PUC19-hAQP2的目的AQP2片段克隆到ANXA11-DYK载体的相应的酶切位点中，用引物鉴定后，获得质粒AQP2-DYK；

II、构建AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型，具体包括如下步骤：

(4)将小鼠足细胞进行细胞培养；

(5)将步骤(3)制得的质粒AQP2-DYK转染至步骤(4)所培养的小鼠足细胞中；