[发明专利]一种用于人结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种用于人结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针、试剂盒及其应用，本发明是通过以下技术方案实现的：针对人基因组SFRP2基因的启动子高GC区域设计一对甲基化特异性Real‑time PCR引物和相应的探针。采用该引物和探针对待测重亚硫酸盐转化后样本进行Real‑time PCR检测，根据扩增结果判定待检样本是否为SFRP2基因甲基化样本，进而判断待检样本是否为结直肠肿瘤性样本。本发明的有益效果如下：1、特异性高：采用结直肠肿瘤特异性标志物，检测结直肠肿瘤的特异性高达92.3％。2、灵敏度高：本发明检测结直肠肿瘤的总灵敏度为76.3％，具体的，检测结直肠癌的灵敏度为84.6％，检测癌前病变的灵敏度为58.3％。

技术领域

本发明属于疾病的筛查和检测领域，具体涉及一种用于人结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌在世界范围内的发病率和死亡率在所有癌症中分别排名第三位和第四位，每年约有136万结直肠癌新发病例和69.4万结直肠癌死亡病例。在中国，癌症发病率和死亡率不断升高。据估计，2015年，中国结直肠癌新发病例达到37.63万，死亡病例达到19.10万，排在所有癌症的第五位。结直肠癌主要发生在50岁以上的人群，且年龄越大，患癌风险越高。绝大多数结直肠肿瘤的发展都经历多个阶段，包括一系列组织学、形态学、基因变异的逐渐积累。累积下来的信号为癌前病变的筛查和检测提供了有利条件，从而实现结直肠癌的超早期检测和早诊早治，可大大降低结直肠癌的发病率和死亡率。

目前结直肠癌筛查的方法较多，但各具优劣势。比如，肠镜能够实现全结肠的可视化，检测远端和近端的病变，且在检测的同时可切除病变组织，但它属于创伤性和侵入性检测，而且需要进行复杂的肠道准备，另外，还伴随肠穿孔以及出血的风险，因此，受检者对肠镜检测的依从性比较差。类似的还有乙状结肠镜检查。直肠指检虽然操作简便，但只能了解距肛门8厘米范围内的病变，无法检测肠道远端病变；愈创木脂粪便隐血试验筛查特异性低，存在大量假阳性，且易受含亚铁离子的食物和药物干扰；CEA、CA19-9属于广谱性肿瘤标志物，筛查灵敏度和特异性都不高。综上，需要探索出一种方便可行、无创、高灵敏度和特异性的肠癌早期筛查方法。

散发性结直肠癌是遗传和表观遗传变异逐渐积累的结果，这些变异累积会导致正常结肠上皮细胞向癌细胞转化。研究指出，结直肠癌发生过程往往伴随着总体低甲基化以及特定基因启动子区域的超甲基化，这些甲基化水平的变化参与细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡、血管生成、粘附和侵袭。因此，基因甲基化是潜在的结直肠癌标志物，可以用于结直肠癌及癌前病变的筛查。SEPT9甲基化检测是FDA和CFDA均批准的第一个也是唯一的基于血液的结直肠癌筛查方法，进一步证明了基因甲基化用于结直肠癌筛查的可行性和有效性。另外，DAVID A.AHLQUIST开展了一项使用粪便DNA检测结直肠癌和腺瘤的研究。在这项研究中，粪便DNA试验主要检测4个基因(BMP3，NDRG4，TFPI2和波形蛋白)的甲基化水平，KRAS基因突变以及血红蛋白。最终，该粪便DNA试验成功检测出85％的结直肠癌患者以及54％的腺瘤(1cm以上)患者，同时特异性高达90％。随后，Thomas F.Imperiale也进行了类似的研究，主要检测粪便DNA中两个基因(BMP3和NDRG4)的甲基化水平、KRAS突变以及血红蛋白，然后使用这四个肿瘤标志物联合筛查结直肠癌以及癌前病变，同时还比较了这种方法和FIT筛查结直肠癌和癌前病变的效果。研究总共募集了9989位志愿者，其中包括65名结直肠癌患者以及757名高级别癌前病变患者。最终结果显示多靶点粪便DNA试验能够检测92.3％的结直肠癌以及42.4％的高级别癌前病变，同时特异性高达86.6％。相比于FIT，多靶点粪便DNA试验检测结直肠癌和癌前病变的灵敏度和准确性均更高。这项研究表明了多靶点粪便DNA试验能够有效的在无症状人群中筛查结直肠癌。以上研究成果证明了粪便DNA甲基化能够应用于结直肠癌和癌前病变的检测。