[发明专利]基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法，其包括以下步骤：

(1) 使组织样本与引物组合物杂交，其中所述引物组合物包括上游引物组和下游引物组，且上游引物中的各引物与其对应的下游引物均结合至同一DNA或基因的单链两侧，所述上游引物组中的各引物分别包括5’端的UID序列和与PCR通用引物对中的一种引物互补的结合区，所述下游引物组中的各引物分别包括与PCR通用引物对中的另一引物互补且位于所述各引物的3'端的结合区；其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至下述基因群组中的至少一种基因的突变位点的上游，和所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至所述突变位点的下游，所述上游引物组由序列为SEQ ID No：1-18的引物组成；所述下游引物组由序列为SEQ ID No：19-36的引物组成；所述基因群组由KIT、MSH2、BIRC3、SLC7A8、ZNF2、MAP4K3、REEP5、DEFB105A、DEFB105B、ACVR2A、RNF43、DOCK3、GTF2IP1、LOC100093631、ARHGEF12、NOMO1、PIP5K1A、KIF14 (dist. = 4,175 bp)和DDX59 (dist. = 19,111 bp)组成；

(2) 在适于DNA聚合酶或DNA连接酶反应的条件下填平间隙缺口，得到靶标DNA；

(3) 以所述靶标DNA为模板利用PCR通用引物对进行扩增，得到测序文库；

(4) 利用二代测序对所述测序文库进行双端测序，得到样本的双端测序数据；

(5) 对于所述双端测序数据分别记为R1和R2，并提取R1序列的UID，将提取UID后的文件比对到参考基因组上，过滤比对结果，提取保留的比对结果的双端测序序列，并进行拼接，其中保留比对结果的条件是唯一比对到参考基因组上，且根据比对位置和随机碱基去重并保留质量最好的一条序列；

(6) 对于组织样本和对照样本，对每个微卫星位点分别统计拼接后序列的长度，若所述组织样本和所述对照样本错峰，且中间相差碱基数大于等于2，则认为该位点不稳定；

(7) 判读标准为：不稳定位点数等于0，所述组织样本为MSS型；不稳定位点数等于1，所述组织样本为MSI-L型；不稳定位点数大于等于2，所述组织样本为MSI-H型。

2.根据权利要求1所述的基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法，其中所述PCR通用引物对包括上游PCR引物和下游PCR引物，且所述上游PCR引物与所述上游引物组中各引物的结合区互补，所述下游PCR引物与所述下游引物组中各引物的结合区互补。

3.根据权利要求1所述的基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法，其中，所述突变位点包括：KIT基因的BAT25突变、MSH2基因的BAT26突变、BIRC3基因的NR27突变、SLC7A8基因的NR21突变、ZNF2基因的NR24突变、MAP4K3基因的MONO-27突变、REEP5基因的D5S346突变、DEFB105A或DEFB105B基因的(A)9突变、ACVR2A基因的(A)8突变、RNF43基因的(C)7突变、DOCK3基因的(C)7突变、GTF2IP1或LOC100093631基因的(T)13突变、ARHGEF12基因的(T)8(C)5突变、NOMO1基因的(A)9突变、PIP5K1A基因的(T)9(C)6突变、KIF14 (dist. = 4,175bp)基因的(T)8突变和DDX59 (dist. = 19,111 bp)基因的(T)8突变。