[发明专利]一种单细胞多巴胺受体亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种单细胞多巴胺受体亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法，其特征在于，针对DAR的5种亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分别设计两轮PCR引物，通过巢式PCR进行两轮扩增，对单个细胞内DAR的5种亚型基因表达进行检测；在巢式PCR扩增的同时，通过对内参基因β-actin的检测来判断所抽提的核酸质量；

所述的DAR的5种亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分别设计的巢式PCR两轮扩增引物序列分别是：

Drd1第一轮PCR引物_F：TCCGATAGTTGGGCTCATCG；

Drd1第一轮PCR引物_R：CTGTTGCAATACCCCCACCC；

Drd1第二轮PCR引物_F：ATAGTTGGGCTCATCGCTGG

Drd1第二轮PCR引物_R：ACCGGGAAGGGGTTCTTCTA；

Drd2第一轮PCR引物_F：AACACACGCTACAGCTCCAA；

Drd2第一轮PCR引物_R：TCATGTCCTCAGGGTGGGTA；

Drd2第二轮PCR引物_F：CCCACTGCTCTTTGGACTCA；

Drd2第二轮PCR引物_R：GCTTGCGGAGAACGATGTAG；

Drd3第一轮PCR引物_F：TGGTTTCAACACAACAGGGGA；

Drd3第一轮PCR引物_R：CCATGGTGGGGCTTAAGGAG；

Drd3第二轮PCR引物_F：CACGGGACAAATGGAGCACA；

Drd3第二轮PCR引物_R：TGGCAGATGCTGTAGTAGCG；

Drd4第一轮PCR引物_F：CTGGGGTCCCACATCAAAGG；

Drd4第一轮PCR引物_R：GCATCCATGGCATCTACCCC；

Drd4第二轮PCR引物_F：CCTGGCCTTTGCTGATTTCC；

Drd4第二轮PCR引物_R：CCACCCAAGAGCAATGGATGA；

Drd5第一轮PCR引物_F：GCATCTACCGCATTGCACAG；

Drd5第一轮PCR引物_R：GACATAGGCAGCAGCGATCT；

Drd5第二轮PCR引物_F：GGCCAACTCCTCTCTCAACC；

Drd5第二轮PCR引物_R：TGTTTACCGTCTGCACGGG；

所述的对单个细胞内DAR的5种亚型基因表达进行检测流程按以下步骤实施：

步骤一，单细胞捕获及细胞内容物抽提；

步骤二，使用逆转录酶对抽提得到的细胞内容物直接进行反转录，制备cDNA；

步骤三，将制备的cDNA全部与DAR亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5，和内参基因β-actin第一轮扩增引物的混合物混合，进行多重PCR扩增；

步骤四，以第一轮扩增产物为模板，分别选取DAR亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5和内参基因β-actin的第二轮扩增引物，针对DAR的5种亚型及内参基因进行特异性PCR扩增；

步骤五，琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测，判断多巴胺受体基因表达；

所述内参基因β-actin的扩增引物序列如下：

内参基因β-actin第一轮PCR引物_F：CTGAGCTGCGTTTTACACCC；

内参基因β-actin第一轮PCR引物_R：ACGCGACCATCCTCCTCTTA；

内参基因β-actin第二轮PCR引物_F：GACAGCAGTTGGTTGGAGCA；

内参基因β-actin第二轮PCR引物_R：TTTTGGGAGGGTGAGGGACT。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两轮巢式PCR的反应条件为：

第一轮扩增：95℃，5min；再进行25个循环：即95℃：30s、55℃：1min、72℃：1min；最后72℃：10min；4℃保存；

第二轮扩增：95℃，5min；再进行30个循环：即95℃：30s、60℃：30s、72℃：30s；最后72℃：10min；12℃保存。