[发明专利]一种用于美丽百合花药培养的分化培养基及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于美丽百合花药培养的分化培养基及其制备方法和应用，其特征在于，该分化培养基的配方如下：

大量元素：NH₄NO₃ 1300~1600mg/L， KNO₃ 1900~2300mg/L，KH₂PO₄ 550~600mg/L，MgSO₄·7H₂O 345~385mg/L，CaCl₂·2H₂O 620~650mg/L；

微量元素：MnSO₄·4H₂O 18~22mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7~9mg/L，H₃BO₃ 9~12mg/L，KI 0.6~0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.22~0.28mg/L；

铁盐：FeSO₄·7H₂O 25~30mg/L，Na₂-EDTA 34~39mg/L；

少量有机添加物：肌醇95~105mg/L，谷胱甘肽34~40 mg/L，脯氨酸10~14mg/L，丙氨酸6~9mg/L，腐植酸钠3.3~4.1mg/L，维生素B1 0.3~0.6mg/L，维生素B6 0.4~0.7mg/L，抗坏血酸0.25~0.30mg/L，牛磺酸0.42~0.48mg/L，复肽核酸0.33~0.37mg/L，马来酰肼2.1~2.7 mg/L；

大量有机添加物：山梨醇12~15g/L，蔗糖22~26g/L，聚乙烯醇0.7~1.0g/L，植物凝胶1~3g/L；

植物提取液：豌豆提取液24~30mL/L，西瓜汁46~53mL/L；

无机添加物：活性炭0.3~0.5g/L，硝酸铈0.8~1.2mg/L；

植物生长调节剂：乙酰胆碱 0.4~0.6mg/L，N6-异戊烯基腺嘌呤 1.0~1.4mg/L，1-萘乙酰胺0.2~0.5 mg/L；

根据以上配方制备分化培养基的步骤如下：

（1）制备母液

大量元素制备成50倍的母液；微量元素、铁盐分别制备成200倍的母液；少量有机添加物中肌醇单独加蒸馏水溶解，制备成100倍母液，其它成分制备成200倍母液；植物生长调节剂乙酰胆碱、N6-异戊烯基腺嘌呤和1-萘乙酰胺分别制备成质量浓度为0.1mg/mL的母液；各种母液制备完后分别储存于玻璃瓶中，其中铁盐母液需要避光，应储存于棕色玻璃瓶中，再将各制备好的母液置于适宜的温度下保存备用；

（2）制备植物提取液

豌豆提取液的制备：将豌豆粒洗净后称取约80g，加入500ml蒸馏水，煮沸30min后取出，再包于4~6层纱布中挤压出汁液，静置后取上清液即获得豌豆提取液，置于4℃冷藏保存；

西瓜汁的提取：将新鲜西瓜瓜瓤取出切成小块，放入榨汁机中榨成汁，稍静置后过滤至密封容器中，置于4℃冷藏保存；

（3）配制混合培养液

先在烧杯中加入300mL蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐、肌醇、其他少量有机添加物、乙酰胆碱和1-萘乙酰胺的母液、豌豆提取液和西瓜汁加入烧杯中，再将称量好的山梨醇、蔗糖、聚乙烯醇、活性炭、硝酸铈加入烧杯中，搅拌溶解；

（4）配制培养基

用天平称取所需的植物凝胶，放入烧杯中，再加入适量的蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状，然后再将上述配好的混合培养液加入到煮沸的植物凝胶中，最后加蒸馏水定容至1 L，搅拌均匀；

（5）调节pH

用滴管吸取物质的量浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，逐滴滴入制备好的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密pH试纸测培养基的pH，调节培养基的pH为5.6~6.0；

（6）培养基分装与高压蒸汽灭菌

待制备好的培养基稍微冷却后，按照50ml /瓶将培养基分装入150ml三角瓶中，塞上胶塞，包上锡箔纸，然后将培养基置于高压蒸汽灭菌锅中，调节温度为121℃、压力为15kPa，灭菌20min；

（7）培养基内添加N6-异戊烯基腺嘌呤

按照50ml /瓶培养基的用量计算需加入的N6-异戊烯基腺嘌呤母液用量，待培养基降温至约45℃时，在超净工作台中向每瓶培养基加入已灭菌的N6-异戊烯基腺嘌呤母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。