[发明专利]一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用

说明书

本发明提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用。根据本发明提供的成套引物由引物REO‑F3‑1，引物REO‑B3‑1，引物REO‑FIP‑1和引物REO‑BIP‑1组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明还将上述成套引物应用于检测或辅助检测待测样品中是否含有小鼠呼肠孤病毒3型，以及鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为小鼠呼肠孤病毒3型。根据本发明建立的RT‑LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、操作简单的特点，具有良好的应用前景和市场推广价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用。

背景技术

小鼠呼肠孤病毒3型(Mouse reovirus type 3，Reo 3)在分类上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae，正呼肠孤病毒属(Orthoreovims)。Reo 3主要通过消化道、呼吸道、空气和粪-口等途径传播，Reo-3在环境中能稳定生存是造成病毒污染的主要原因。小鼠发生感染时，急性病例主要见于新生乳鼠和断乳小鼠，慢性病例则见于28日龄以上的小鼠，其临床表现以油性被毛效应和脂肪性下痢为特征。病理变化主要表现为肝炎、脑炎和胰腺炎，它可使感染小鼠体内产生胰淀粉酶、脂肪酶活性降低，胰蛋白酶活性升高；也可破坏胰岛的β细胞，造成胰岛素分泌减少，产生类似糖尿病的代谢和病理改变，Reo 3在宿主对环境致癌物的应答中还起到免疫刺激的作用，严重干扰动物试验，是实验小鼠较严重的病毒病之一。

Reo 3也是国标《实验动物微生物学等级及监测》(GB14922.2-2011)要求SPF级实验大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠必检的项目之一，检测结果要求为阴性。定期抽样检测是预防和控制鼠群中Reo 3感染的重要手段。国标《实验动物呼肠孤病毒III型检测方法》(GB/T14926.25-2001)推荐间接ELISA方法检测小鼠血清中Reo 3抗体，间接ELISA简便快捷，但每种方法均有其局限性，以下几种情况用间接ELISA方法检测血清抗体不适用：①当小鼠感染病毒初期抗体尚未产生，或隐性带毒鼠的血清抗体水平较低，血清学检测方法有可能检不出。②裸小鼠有免疫缺陷，感染病毒后不易产生抗体，用间接ELISA方法检测易产生假阴性。③转基因小鼠存在非特异性抗体增高的现象，即特异性抗原孔OD值增高的同时，对照孔的OD值也同时增高，说明用间接ELISA方法检测费转基因小鼠病毒抗体的本底值较高，易产生假阳性。因此建立一种高效、便捷、稳定的直接检测Reo-3抗原的方法，与间接ELISA方法互为补充，以便应用于所有类型小鼠的检测对于控制Reo 3的发生具有重要意义。

环介导恒温扩增法(即LAMP法)是日本学者Notomi等在2000年发明一种新型的核酸扩增新技术。它通过内、外、环三对引物识别靶序列上的8个特异区域，和Bst DNA聚合酶在恒温(60～65℃)下形成瀑布式的核酸高效扩增。LAMP方法具有特异性强、等温高效、结果可视化、操作简单等优点，扩增效率远高于传统的核酸检测方法，因此LAMP技术自开发以来已广泛应用于细菌、病毒的定性定量检测，临床疾病的诊断，动植物中致病微生物的检测，胚胎性别鉴定等相关领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用，从而解决现有技术中缺乏有效检测小鼠呼肠孤病毒3型的方法的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物，所述成套引物由引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

所述成套引物中，所述引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1的摩尔比为1∶1∶8∶8。