[发明专利]甘蔗原生质体超低温保存方法

说明书

本发明公开了甘蔗原生质体超低温保存方法，以甘蔗幼叶用2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.1％离析酶+0.3％半纤维素酶的酶液常温酶解4h，采用65％～75％的KM8P培养基+20％的小牛血清蛋白+5％～15％的二甲基亚砜作为冻存液，将装有细胞悬液的冻存管首先放入4℃中40min，之后置于‑20℃中30～60min，再置于‑80℃放置过夜，最后置于‑80℃冰箱中或‑196℃液氮罐中保存；解冻复苏为取出冻存管放入37℃的恒温水浴锅中不断摇晃致解冻，然后离心弃掉冻存液，用含9％甘露醇清洗3遍，用KM8P培养基培养得到得到保存后的原生质体。本发明方法能优化甘蔗原生质体冻存条件、降低冻存液的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性、保证甘蔗遗传稳定性，提高保存后的复苏活力。

技术领域

本发明属于植物种质资源的细胞保存技术领域，特别是甘蔗原生质体超低温保存方法。

背景技术

植物体细胞融合育种，是根据细胞的全能性和细胞膜的流动性原理，用酶解法去除细胞壁，将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂合体植株的技术。其打破了有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有形成有性杂交方法所无法获得的新型杂合体植株，而且细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，转移的基因基本不存在基因安全性问题，因为被转移的基因本身存在于甘蔗中，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，加之体细胞杂交来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作物所期望的。植物体细胞融合育种是改造细胞遗传物质的有力手段，有着重大的实践意义。

原生质体是体细胞融合的必需材料，同时还可以用于突变体筛选和遗传转化等研究，是科学研究的理想材料。由于植物材料的获得受季节和植物生长发育阶段的影响，导致原生质体融合育种等实验也会受到以上因素的限制，实验不能随时随地进行。当前国内对原生质体的获得，大多数是及时采样并且及时酶解。这样做的缺点是：酶解耗时长；未用完的原生质体只能培养要么丢弃，效率低；材料的季节性导致有些季节实验因没有材料而搁置。原生质体冻存技术可以很好的解决这些问题。超低温条件能够较好保存种质资源。随着原生质体再生植株种类的不断增多，玉米、水稻、小麦等禾谷类的主要农作物的原生质体也成为种质保存的重要材料。冻存过程对原生质体的主要伤害是冰晶刺破的伤害，二甲基亚砜(DMSO)是一种高效的渗透性保护剂，可迅速渗透细胞，降低细胞内细胞液冰点是低温保护剂，它易于透入细胞内部，使之不至于在细胞冻融时因强烈脱水而损伤。目前，许多实验室广泛采用DMSO作冻存保护剂，除了价格低廉、保护效果良好外，DMSO另一特点是很容易洗脱干净。但不同浓度DMSO会触发冻存细胞复苏后大量细胞凋亡，对细胞有一定的毒害作用。如何优化植物原生质体冻存条件，降低冻存试剂的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性是体细胞融合育种顺利进行的重要环节之一。

甘蔗是我国食糖工业的重要支柱，也是能源、纤维、糖基化工和饲料的原料，作为再生能源作物，甘蔗有很大的潜力。然而蔗糖生产中存在着糖料蔗品种单一，选育的新品种不能满足甘蔗生产需求等问题，严重影响了蔗糖业健康稳定发展和竞争能力的进一步提高。因此，增强甘蔗育种的创新力度，提供更多优良的甘蔗品种已成为糖业发展，乃至经济发展急需解决的问题。

由于甘蔗不仅生育期长，而且是亚热带作物，生长受季节和地域性的限制，如果缺乏合适的甘蔗原生质体冻存方法，会导致甘蔗原生质体融合育种研究不在甘蔗生长季节和亚热带地区时，找不到研究材料，而在生长季节时大量的实验材料因无法得到及时利用和长期保存而被浪费，极大地限制了甘蔗体融合育种研究顺利进行。因此，研究甘蔗原生质体冻存方法，为后期甘蔗原生质体的融合育种以及以甘蔗原生质体为受体进行遗传转化等研究提供储备材料，为体细胞融合育种、遗传学和转基因提供材料和技术支撑。

发明内容

本发明提供了一种甘蔗原生质体超低温保存方法，该方法能优化甘蔗原生质体冻存条件、降低冻存试剂的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性、保证甘蔗遗传稳定性，提高保存后的复苏活力。