[发明专利]一种利用南方红豆杉菌根菌与活组织细胞共培养生产紫杉醇及10-DABⅢ的方法

说明书

一种利用南方红豆杉菌根菌与其活组织细胞共培养生产紫杉醇及10‑DABⅢ的方法，包括步骤：1）南方红豆杉菌根诱导与采集；2）菌根菌分离培养基的配置；3）菌根菌分离培养筛选菌株（E20）；4）菌株复壮；5）液体菌种培养；6）预备南方红豆杉活组织细胞；7）E20菌株与南方红豆杉离体活组织细胞密闭避光共培养；8）提取纯化。本发明通过自主从南方红豆杉菌根中分离筛选获得的E20菌株与南方红豆杉活枝叶细胞、愈伤组织细胞离体共培养，利用两者离体重建共生互作关系过程实现持续、稳定地提高体系紫杉醇及10‑DABⅢ产率，可使10‑DABⅢ和紫杉醇的含量提高。操作简单、环保、效率高。

技术领域

本发明属生物工程与生物制药领域，具体涉及一种利用植物活组织细胞与菌根菌共培养重建共生互作体系生产植物药用次生代谢成分或其前体物的方法。

背景技术

红豆杉在全世界有11种和数个变种，在北半球温带至热带地区均有分布。目前发现的主要种类有短叶红豆杉（Taxus. brevifolia Nutt.）、加拿大红豆杉（T. cannadlensis Marsh.）、球果红豆杉（T. globose）、杂种紫杉（T. media Rehd.）、欧洲红豆杉（T. baccata L.）、佛罗里达红豆杉（T. floridana Chapm.）、东北红豆杉（T. cuspidata Sieb. et Zucc.）、云南红豆杉（T. yunnanensis Cheng et L. K. Fu）、中国红豆杉 （T. chinesis Rehd. Chinese Yew）、南方红豆杉（T. chinensis var. mairei Cheng et L.K. Fu）及西藏红豆杉（T.wallichinana Zucc.）等；其中我国有 4 种 1 变种，即南方红豆杉（变种）、云南红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉，分布于华中、华南、华东、西南、西藏、东北、西北等地，但较集中的产区为西南、东北以及华南地区。本发明所涉及南方红豆杉在我国西南、华南地区广为分布，易栽培，生长速度较快，但其枝叶、树皮中紫杉醇及10-DABⅢ的含量均较低（0.08‰～0.2‰），根据提取成本与市场价值估算，基本不具备商业提取价值。

目前紫杉醇生产主要有2种途径，即从红豆杉属植物中直接提取紫杉醇，或提取紫杉醇的前体物10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DABⅢ），然后化学半合成紫杉醇或多西紫杉醇。紫杉醇结构复杂，化学全合成工艺繁琐，成本高，无商业应用价值。所报道产紫杉醇内生真菌和工程菌，由于产紫杉醇能力较低，且不稳定，亦无工业化生产报道。以10-DABⅢ为前体物化学半合成紫杉醇虽已应用于工业化生产，但仍依赖红豆杉植物资源，且基本依赖从国外进口欧洲红豆杉原料，成本居高，且原料生产周期长，很难满足市场需求。细胞组织培养生产紫杉醇，由于放大的稳定性、成本等原因，技术还不够成熟。所以，寻求低成本、稳定的紫杉醇药源，一直是本领域研究的重点与热点。

专利申请号：201010560051.1，公开号：CN 102071230 A，发明名称：一种利用微生物发酵法从红豆杉中提取紫杉醇的方法。该方法是利用酵母菌发酵好的发酵液浸泡红豆杉枝叶粉末数天，然后对浸泡液进行浓缩，喷雾干燥即可得到高含量的紫杉醇干品。该技术的特点是利用生物酶解法提取红豆杉中的紫杉醇，提取时间短，工艺简化，提取效率高，降低了成本，且无污染，但与生物互作提高植物次生代谢产物含量原理无关。