[发明专利]一种玉米赤霉烯酮脱毒方法有效
申请号: | 201810964751.3 | 申请日: | 2018-08-23 |
公开(公告)号: | CN109136300B | 公开(公告)日: | 2022-01-25 |
发明(设计)人: | 李金贵;刘明江;时从来;韩一晴;徐玉泉 | 申请(专利权)人: | 扬州大学 |
主分类号: | C12P17/08 | 分类号: | C12P17/08;C12N15/52;C12N15/81;C12N9/00;C12N1/19 |
代理公司: | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人: | 薛海霞;董建林 |
地址: | 225009 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 玉米 赤霉烯酮 脱毒 方法 | ||
1.一种玉米赤霉烯酮脱毒方法,其特征在于:利用可可毛色二孢菌的氧甲基修饰酶Lt-OMT将玉米赤霉烯酮的3位羟基(-OH)替换为氧甲基基团(-OCH3);Lt-OMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;Lt-OMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述方法的反应式为:
2.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法,其特征在于:将Lt-OMT的基因与pRS425载体连接构建人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu,将人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu转入感受态酵母细胞中,将酵母细胞置于Leu营养缺陷型培养基中培养,在Leu营养缺陷型培养基中加入玉米赤霉烯酮实现共培养,酵母细胞合成的Lt-OMT将玉米赤霉烯酮转化为3-OCH3-ZEN。
3.根据权利要求2所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法,其特征在于:具体步骤为:
(1)基因克隆:
根据Lt-OMT的核苷酸序列设计正链和反链引物,通过PCR的方法,获得目的基因Lt-OMT;
(2)重组质粒的构建:
①利用限制性内切酶NdeI、PmeI酶切Lt-OMT PCR产物和pRS425载体,通过T4DNA连接酶将酶切后Lt-OMT基因片段与酶切后pRS425载体连接构建重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu;
②将重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu导入感受态大肠杆菌DH5α细胞中表达,碱裂解法提取质粒,利用NdeI和PmeI酶切质粒后进行琼脂糖电泳验证目的基因是否完整;
(3)酵母转化:
将构建的92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒导入感受态酵母细胞BJ5464-NpgA中;
(4)玉米赤霉烯酮和酵母转化子共培养:
将10mg玉米赤霉烯酮置于含有酵母转化子的营养缺陷型-Leu培养液中培养48h;所述酵母转化子为含有1μg 92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒的酵母细胞;
(5)发酵产物提取;
(6)纯化转化产物:
通过硅胶柱层析法,用不同比例的流动相分离粗提物的各组分,收集各馏分;将各馏分进行薄层色谱点板,筛选目标化合物;
(7)转化产物结构分析。
4.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法,其特征在于:步骤(5)的具体步骤为:
①将发酵液1580g离心5min,分别收集上清液、沉淀物;
②将①中上清液与等体积的乙酸乙酯混合,充分混匀后倒入分液漏斗里,静置分层,分别收集上清液、沉淀物;
③将步骤②的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀,静置分层,分别收集上清液、沉淀物;
④将步骤③的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀,静置分层,分别收集上清液、沉淀物;
⑤将步骤②③④上清液混合并转入旋转蒸发仪,浓缩至膏状;
⑥在①沉淀物中加入3倍体积甲醇并超声15min,倒入分液漏斗里,静置分层,分别收集上清液、沉淀物;
⑦将步骤⑥沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀,反复抽提三次,合并三次上清液;
⑧将步骤⑦上清液转入旋转蒸发仪,浓缩至膏状;
⑨将步骤⑤⑧获得的浓缩物用色谱甲醇复溶,用0.22μm滤膜过滤后,13400g离心10min,上清液装入棕色液相进样瓶中备用。
5.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法,其特征在于:步骤(7)的具体步骤为:
①发酵产物经高效液相色谱法分析,4.790min的玉米赤霉烯酮底物峰消失,在4.175min生成一个新峰;
②收集转化产物馏分,即4.175min处化合物,旋转蒸法至白色晶体粉末析出并称重;
③经质谱分析仪分析新化合物的分子量为333.8;
④经核磁共振法分析得出,新化合物结构为3-OCH3-ZEN;
⑤分析得出该酶在酵母发酵系统BJ5464-NpgA内对玉米赤霉烯酮的转化效率为98%。
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