[发明专利]一种玉米赤霉烯酮脱毒方法

权利要求书

1.一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：利用可可毛色二孢菌的氧甲基修饰酶Lt-OMT将玉米赤霉烯酮的3位羟基(-OH)替换为氧甲基基团(-OCH₃)；Lt-OMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Lt-OMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述方法的反应式为：

2.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：将Lt-OMT的基因与pRS425载体连接构建人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu，将人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu转入感受态酵母细胞中，将酵母细胞置于Leu营养缺陷型培养基中培养，在Leu营养缺陷型培养基中加入玉米赤霉烯酮实现共培养，酵母细胞合成的Lt-OMT将玉米赤霉烯酮转化为3-OCH₃-ZEN。

3.根据权利要求2所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)基因克隆：

根据Lt-OMT的核苷酸序列设计正链和反链引物，通过PCR的方法，获得目的基因Lt-OMT；

(2)重组质粒的构建：

①利用限制性内切酶NdeI、PmeI酶切Lt-OMT PCR产物和pRS425载体，通过T4DNA连接酶将酶切后Lt-OMT基因片段与酶切后pRS425载体连接构建重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu；

②将重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu导入感受态大肠杆菌DH5α细胞中表达，碱裂解法提取质粒，利用NdeI和PmeI酶切质粒后进行琼脂糖电泳验证目的基因是否完整；

(3)酵母转化：

将构建的92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒导入感受态酵母细胞BJ5464-NpgA中；

(4)玉米赤霉烯酮和酵母转化子共培养：

将10mg玉米赤霉烯酮置于含有酵母转化子的营养缺陷型-Leu培养液中培养48h；所述酵母转化子为含有1μg 92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒的酵母细胞；

(5)发酵产物提取；

(6)纯化转化产物：

通过硅胶柱层析法，用不同比例的流动相分离粗提物的各组分，收集各馏分；将各馏分进行薄层色谱点板，筛选目标化合物；

(7)转化产物结构分析。

4.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：步骤(5)的具体步骤为：

①将发酵液1580g离心5min，分别收集上清液、沉淀物；

②将①中上清液与等体积的乙酸乙酯混合，充分混匀后倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

③将步骤②的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

④将步骤③的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑤将步骤②③④上清液混合并转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑥在①沉淀物中加入3倍体积甲醇并超声15min，倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑦将步骤⑥沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，反复抽提三次，合并三次上清液；

⑧将步骤⑦上清液转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑨将步骤⑤⑧获得的浓缩物用色谱甲醇复溶，用0.22μm滤膜过滤后，13400g离心10min，上清液装入棕色液相进样瓶中备用。

5.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：步骤(7)的具体步骤为：

①发酵产物经高效液相色谱法分析，4.790min的玉米赤霉烯酮底物峰消失，在4.175min生成一个新峰；

②收集转化产物馏分，即4.175min处化合物，旋转蒸法至白色晶体粉末析出并称重；

③经质谱分析仪分析新化合物的分子量为333.8；

④经核磁共振法分析得出，新化合物结构为3-OCH₃-ZEN；

⑤分析得出该酶在酵母发酵系统BJ5464-NpgA内对玉米赤霉烯酮的转化效率为98％。