[发明专利]具有溶磷活性的重组微生物的构建方法与应用

说明书

本发明公开了具有溶磷活性的重组微生物的构建方法与应用。本发明所提供的构建具有溶磷活性的重组微生物的方法包括将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物，得到溶磷活性高于所述受体微生物的具有溶磷活性的重组微生物。本发明通过赋予受体微生物(巨大芽孢杆菌WH320)葡萄糖脱氢酶CrGDH3A的活性构建具有溶磷活性的重组微生物，该重组微生物对磷酸三钙的溶磷能力是受体微生物的11.59倍，对磷酸铝的溶磷能力是其相应的受体微生物的16.23倍,对磷矿粉的溶磷能力是其相应的受体微生物的14.00倍。

本申请是申请号为201611153688.2、申请日为2016年12月14日、发明创造名称为“表达葡萄糖脱氢酶的工程菌及其构建方法与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有溶磷活性的重组微生物的构建方法与应用。

背景技术

在农业生产上，增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径。我国每年大约消耗2100万～2200万吨磷肥，但是磷肥当季作物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物。磷是不可再生资源，随着磷矿储备的不断消耗，我国可能面临磷矿短缺而严重制约粮食生产。其实土壤中本不缺磷,但是它在土壤中的有效性非常低,多为难溶性的无机磷，植物很难吸收利用。因此，活化土壤中无效磷素，是农业生产急需解决的问题之一。

葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)属于短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶存在下，能够催化D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而生成的D-葡萄糖酸-δ-内酯会进一步自发地水解成葡萄糖酸。研发具有高活性的葡萄糖脱氢酶进而构建葡萄糖脱氢酶溶磷工程菌，可以显著提高溶磷细菌分解土壤无机磷的能力，在活化土壤无效磷素、提高磷肥利用率、减少磷肥投入方面具有重大价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何构建具有溶磷活性的微生物。

为了解决以上技术问题，本发明提供了具有溶磷活性的重组微生物。

本发明所提供的具有溶磷活性的重组微生物，是通过赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性来制备；所述具有溶磷活性的重组微生物的溶磷活性高于所述受体微生物。

上述重组微生物中，所述赋予受体微生物葡萄糖脱氢酶活性通过将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物中实现。

为了解决以上技术问题，本发明提供了构建具有溶磷活性重组微生物的方法。

本发明所提供的构建具有溶磷活性重组微生物的方法，包括将葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物，得到溶磷活性高于所述受体微生物的具有溶磷活性重组微生物；所述葡萄糖脱氢酶为a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。

本申请中，所述溶磷活性是指将无机磷转化为可溶性磷的能力。其中，可溶性磷指能溶解到水中或溶解到弱酸中后可被植物吸收利用的磷。可溶性磷包括水溶性磷和/或可交换性磷。所述无机磷可为难溶的磷酸盐(如磷酸三钙或磷酸铝)或磷矿粉。

上述方法中，a)所示的蛋白质的名称为CrGDH3A；SEQ ID No.2由796个氨基酸残基组成。