[发明专利]一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺

权利要求书

1.一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒，其特征是：包括包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板和包被HCMV重组抗原S的酶标板、辣根过氧化物酶标记的HCMV重组抗原S和标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照和阳性对照。

2.一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的制备工艺，其特征是：所述包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板的制备方法是：用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液将鼠抗人-IgM单克隆抗体稀释至合适浓度，然后再包被到空白的酶标板上，达到最佳的包被效果；

所述辣根过氧化物酶标记的重组蛋白S的制备方法是：

A.HCMV重组蛋白S的获取

(1)根据NCBI中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV(pp150+gp52+pUL57)基因编码序列，人工合成基因pp150的aa862-1048、gp52的aa297-433以及pUL57的aa545-601序列，三种基因之间用G₄S链接子连接，将其克隆到PET28a载体上，并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE鉴定；

(2)将表达HCMV重组蛋白S的大肠杆菌大量培养，诱导，收集菌体，超声破碎并离心收集上清，镍柱层析纯化后得到大量HCMV重组蛋白S；

B.辣根过氧化物酶标记HCMV重组抗原S：

(1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；

(2)加入0.2ml新配的0.1M过碘酸钠(NaIO₄)溶液，室温下避光搅拌20min，然后装入透析袋中，对1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；

(3)加20μl 0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg重组抗原S，室温避光轻轻搅拌2h；

(4)加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠NaBH₄溶液，混匀，放置4℃2h，然后装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；

(5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；

3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH 7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存；

所述包被重组抗原S的酶标板的制备方法是同包被鼠抗人-IgM单克隆抗体方法。

所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体的制备方法是：采用过碘酸钠法将抗体与HRP偶联，具体方法同重组抗原S标记方法。

3.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述检测HCMV IgM使用的阳性对照为含HCMV IgM抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgM阴性的血清；所述检测HCMV IgA使用的阳性对照为含HCMV IgA抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgA阴性的血清；标本稀释液为含10％胎牛血清的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液；显色液为TMB-H₂O₂尿素溶液；终止液为2M的硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺，其特征在于：所述重组蛋白S的氨基酸序列如SEQ No.1所示。

5.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺，其特征在于：所述重组蛋白S的核苷酸序列如SEQ No.2所示。