[发明专利]一种仙茅叶片离体培养与植株再生方法

说明书

本发明公开了一种仙茅叶片离体培养与植株再生方法，包括外植体的选择、外植体的清洁与消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖与生根等步骤。本发明成功建立了低成本仙茅的组培快繁体系，为实现对仙茅野生资源的保护、人工栽培、种苗培植以及基因库的建立奠定了技术基础，解决仙茅野生资源过度开发、药材供应少和种植不成规模、种植受种苗供应限制、药材质量不稳定等问题。

技术领域

本发明涉及中药材的组培快繁方法，属于植物组织培养及中药材种植领域，特别涉及一种仙茅叶片离体培养与植株再生方法。

背景技术

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)为石蒜科仙茅属草本植物，以根状茎入药，有补肾阳，强筋骨，祛寒湿的功效，主要用于阳痿精冷，筋骨痿软，腰膝冷痛，阳虚冷泻等症。

仙茅主要分布于云南、贵州、四川、广西、广东、湖南、福建、台湾、江西、浙江等地，生于海拔1600m以下的林中、草地或荒坡上。也分布于东南亚各国至日本。

目前仙茅作为药材的来源基本为野生资源，几乎无人工种植。随着市场需求量的激增，其市场价格近十年来增长近10倍。同时有限的野生资源不但不能满足市场需求，仙茅可能将出现资源濒临灭绝的危险。部分个人及单位已逐渐开始开展仙茅的人工种植试验，人工进行根状茎切芽繁殖、种子繁殖研究，发现其存在根状茎切芽繁殖时繁殖率低，根腐病严重，种子繁殖时种子采收难度大(种子在茎基部地表部)、种子量少、种子发芽率低等缺点，难以采用传统的繁殖方式进行规模化、规范化人工种植。近年来，国内外企事业单位开展了仙茅的组培技术研究，但均采用地下根状茎作为外植体进行繁殖，存在污染率高，诱导率低等缺点，同时，在增殖过程中褐化情况严重，需扩增后需再次接种于生根培养基中，存在苗长势较弱、生产成本相对较高等缺点。

发明内容

本发明针对以上所述现有技术的不足，发明了一种组分简单、操作简便、生产周期短、经诱导出芽后可一步成苗的仙茅组培技术，可为规模化种植短期内快速提供优质种苗的繁育方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种仙茅叶片离体培养与植株再生方法，包含以下步骤：外植体的选择、外植体的清洁与消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖与生根；优选地，所述的外植体的选择包含以下步骤：将健壮植株栽植于室内，每隔3天用75％多菌灵500倍液喷施5次以上，选取健壮无病虫害心叶作为外植体；

优选地，所述的外植体的清洁与消毒包含以下步骤：将选取的外植体用饱和肥皂水溶液涮洗10-15min，用自来水涮洗至无肥皂水残留，后加适量水，滴3-4滴吐温-80，振摇10-15min，在自来水下冲淋50-70min，转移至超净工作台上，先用75％酒精消毒10-15s，无菌水涮洗3-4次，饱和漂白粉溶液消毒20-30min，无菌水涮洗3-4次，0.05％升汞溶液消毒10-15min，无菌水涮洗6-8次；

优选地，所述的丛生芽诱导包含以下步骤：将消毒好的外植体，剪去接触消毒液的伤口，并将其切成长度0.5-1.0cm的小段，并在小段叶片正面用手术刀将表皮交叉划伤，造成人为性伤口，接种于MS+2,4-D 0.1-0.5mg/L+6-BA 1.0-3.0mg/L+活性炭0.5g/L的丛生芽诱导培养基上，培养温度为23-27℃，培养光照为前15天暗培养，15天后以光照强度1000-2000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养35-45天；

优选地，所述的丛生芽的增殖与生根包含以下步骤：初代诱导出的丛生芽沿叶鞘基部及以下切除，保留叶片，并将保留的叶片剪成0.2-0.5cm长度的小段，接种于MS+TDZ0.1-0.7mg/L+NAA 0.05-0.3mg/L+硝酸银1.0μg/L+活性炭0.5g/L的增殖生根培养基上，培养温度为23-27℃，前15天为暗培养，15天后以光照强度1000-2000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养35-45天。

本发明的有益效果在于：