[发明专利]一种检测水样雌激素结合活性的生物传感分析方法

说明书

本发明公开了一种检测水样雌激素结合活性的生物传感分析方法。该方法以雌激素受体作为生物识别分子，将信号探针和传感芯片置于待测水样中，所述传感芯片捕获所述信号探针，并对所述信号探针中的荧光标记分子进行激发，所述荧光标记分子被激发后的荧光强度与所述待测水样中的雌激素含量成正比，即由所述荧光标记分子被激发后的荧光强度计算得到所述水样中的雌激素含量；所述信号探针为荧光标记的雌二醇‑链霉亲和素缀合物。该方法可实现水样雌激素结合活性的定量分析，生物传感界面可稳定再生，极大降低检测成本，具有经济、简便、快速的优点，且易于实现在线和原位监测。

技术领域

本发明涉及一种检测水样雌激素结合活性的生物传感分析方法，属于环境监测分析领域。

背景技术

水体复合污染包含结构各异、种类复杂的有毒有害化学污染物，单一以浓度表征水体复合污染及其风险具有较大的局限性。随着对环境污染效应导向分析的日益重视，以核受体为识别元件的生物传感分析方法得到了快速发展。雌激素受体是类固醇激素受体蛋白超家族中能与雌激素特异性结合的一种核受体蛋白分子。不同的雌激素污染物与雌激素受体结合后会诱导受体蛋白发生结构变化，形成或抑制二聚体的形成，进而产生不同的生物学效应，表现出拟雌激素活性或抗雌激素活性。无论是哪种表现形式，污染物与雌激素受体的结合是核受体介导雌激素效应表达的起始事件，具有高度特异性。基于这一原理，2005年Arnaud Pillon等利用受体对雌激素的亲和反应过程，从混合样品中分离筛选潜在的新兴雌激素类内分泌干扰物。该方法利用大肠杆菌表达带有6×His标签的重组人雌激素受体蛋白(hERα)，重组雌激素受体蛋白结合在含镍柱材上，雌激素类物质能通过与雌激素受体结合而与样品中其他物质分离，随后将结合的雌激素进行洗脱，结合LC-MS、NMR等技术进行物质鉴定和浓度测试。该方法与传统的用于雌激素化合物检测的生物学方法相比效率更高、操作更简便，但后续需要与LC-MS、NMR等技术联用对雌激素污染物进行浓度定量分析，一方面极大提升了检测的复杂程度及检测成本，另一方面无法完整表征水样的雌激素结合活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测水样雌激素结合活性的生物传感分析方法。

本发明提供的对水样雌激素结合活性定量分析方法，包括：

以雌激素受体作为生物识别分子，将信号探针和传感芯片置于待测水样中，所述传感芯片捕获所述信号探针，并对所述信号探针中的荧光标记分子进行激发，所述荧光标记分子被激发后的荧光强度与所述待测水样中的雌激素含量成正比，即由所述荧光标记分子被激发后的荧光强度计算得到所述水样中的雌激素含量；

所述信号探针为荧光标记的雌二醇-链霉亲和素缀合物。

上述方法中，所述雌激素具体为雌二醇。

所述生物识别分子固载在凝胶柱上；所述凝胶柱具体为含镍琼脂糖凝胶柱；固载方式为各种常规方法。具体的，固载方法可包括如下步骤：将含有生物识别分子的溶液加入到镍柱琼脂糖凝胶柱材中摇荡孵育，离心弃上清液，用纯化缓冲液洗去杂蛋白而得。具体的，所述摇荡孵育步骤中，温度为1-5℃，具体为4℃；时间为1-3h；具体为2h。

所述荧光标记的雌二醇-链霉亲和素缀合物具体可按照如下步骤制得：

1)合成羧基化雌二醇:将4mgβ-雌二醇17-半琥珀酸酯溶于200uL 1,4-二氧己环中，随后向该溶液中加入4.8μl三正丁胺和2.6μl氯甲酸异丁酯,4℃反应1小时后，加入用1.44mL 1,4-二氧己环稀释的6μL 5-氨基戊酸，于室温反应2小时后加入3.3mL 0.1M磷酸钠(pH 7.0)终止反应而得；

2)称取5mg羧基化雌二醇溶于1mL DMF中，磁力搅拌使其完全溶解，加入2.441mgNHS和8.747mg DCC活化羧基，室温下磁力搅拌4h后，以2000r/min离心10min，收集上清，为溶液A。