[发明专利]体外重编程制备视网膜节细胞的方法

说明书

本发明提供一种体外重编程制备视网膜节细胞的方法，所述的方法包括：获取染色体上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的体细胞；诱导培养，获得视网膜节细胞；所述诱导培养包括：先将所述体细胞接种于添加有强力霉素的MEF培养基中培养1～3天；再更换为添加有强力霉素的DMEM/F12与神经细胞培养基的混合培养基培养11～13天；并且，在所述诱导培养开始的第1至5天，所述培养基中添加FGF2。本发明在重编程过程中选择细胞生长因子FGF2添加至诱导培养基，特别是配合选择合适的时机加入，重编程效率可达30％以上。

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种体外重编程制备视网膜节细胞的方法。

背景技术

自诺贝尔奖得主山中伸弥发现通过过表达Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四个转录因子可以将体细胞重编程为多能干细胞(iPS)以来，人们陆续发现通过过表达组织特异性转录因子可以将体细胞直接重编程为其它谱系的体细胞，而无需经过多能干细胞阶段(体细胞直接重编程)。2010年，美国的Marius Wernig实验室发现同时过表达Ascl1，Brn2和Myt1l，可以将小鼠成纤维细胞高效地直接重编程为Tuj1阳性的神经元(Nature 2010，463：1035-41)。这一发现为再生治疗神经退行性疾病开辟了崭新，方便而快捷的供体细胞制备途径。但是这一方法得到的神经元仅仅是普通的泛神经元，而治疗各种神经退行性疾病需要针对此疾病的特定神经元亚型。为此，人们通过筛查不同的因子组合实现了体细胞直接重编程制备多巴胺神经元，运动神经元等神经元亚型的有效方法。但是当前尚缺乏体细胞直接重编程制备视网膜神经元的有效方法。

在发病率最广泛的视网膜退行性疾病-青光眼中视网膜节细胞受到损害而永久丢失，导致视力不可逆丧失。视网膜节细胞移植治疗有望解决青光眼不治之难题。因此建立体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法具有巨大的临床应用价值，但当前在此领域进展有限。虽然有报道，过表达Ascl1，Brn3b和Ngn2可以将小鼠成纤维细胞重编程为Brn3a阳性的视网膜节细胞样细胞(Neuroscience 2013,250:381-93)，但是此报道中的方法获得视网膜节细胞样神经元的效率不够高。

申请号为2018104904910的在先申请，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞，重编程直接获得视网膜节细胞，但是重编程效率较低，仅能达到10％。

因此，亟待探索一种效率高的体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种提高体外重编程制备视网膜节细胞效率的方法。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种体外重编程制备视网膜节细胞的方法，所述的方法包括：

(1)获取染色体上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的体细胞；

(2)诱导培养，获得视网膜节细胞；

所述诱导培养包括：

先将所述体细胞接种于添加有FGF2、强力霉素的MEF培养基中培养1～3天；

再更换为添加有FGF2、强力霉素的DMEM/F12与神经细胞培养基的混合培养基中培养至第5天；

然后更换为添加强力霉素的DMEM/F12与神经细胞培养基的混合培养基中培养6～8天。

在其中一个实施例中，所述的培养基中添加有5～40ng/ml的FGF2。

在其中一个实施例中，所述的培养基中添加有10～40ng/ml的FGF2。

在其中一个实施例中，所述诱导培养包括：