[发明专利]一种濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法

权利要求书

1.一种濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤1：外植体选取与消毒：选取富民枳嫩芽并进行冲洗后剪成含有叶腋的茎段，对茎段进行消毒；

步骤2：腋芽启动培养：将步骤1中的茎段斜插于腋芽启动培养基上进行培养，得到萌生腋芽；

步骤3：增殖培养：将经步骤2得到的腋芽插于增殖培养基上，腋芽基部形成大量丛生芽，将丛生芽进行切割分离，接种于相同增殖培养基培养，得到增殖培养幼苗；

步骤4：生根培养：将步骤3得到的增值培养幼苗切下，接种于生根培养基上进行培养，得到富民枳生根苗。

2.根据权利要求1所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤1的具体步骤是：选取富民枳树体春季萌生嫩茎，去除叶片；去除表面杂质，加洁尔灭用净水冲洗0.5h以上，剪成2～3cm长含1～2个叶腋的茎段，置于超净工作台采用75％乙醇浸泡10～12s进行消毒，无菌蒸馏水冲洗2次，移入0.1％升汞浸泡处理10min，无菌水冲洗3～5次，用消毒滤纸吸干外植体表面残留水分后进行接种。

3.根据权利要求1或2所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤2的具体步骤是：步骤1中的茎段两端、叶柄、尖刺分别切去2～4mm，斜插于启动培养基上，近顶端叶腋向上，置于光照强度1000～2000Lux，光照12小时/天，昼温25±2℃，夜温20±2℃的条件下光照培养10～15d，得到萌生腋芽。

4.根据权利要求1或2所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤3的具体步骤是：将经步骤2得到的腋芽沿基部切下，摘去底部1～2个叶片，竖直插于增殖培养基上，置于光照强度1000～2000Lux，光照12小时/天，昼温25±2℃，夜温20±2℃的条件下光照培养15～20d，腋芽基部形成大量丛生芽，将丛生芽按2～3株为一组进行切割分离，接种于相同增殖培养基，在相同条件下继续培养30d，得到增殖培养幼苗。

5.根据权利要求3所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤3的具体步骤是：将经步骤2得到的腋芽沿基部切下，摘去底部1～2个叶片，竖直插于增殖培养基上，置于光照强度1000～2000Lux，光照12小时/天，昼温25±2℃，夜温20±2℃的条件下光照培养15～20d，腋芽基部形成大量丛生芽，将丛生芽按2～3株为一组进行切割分离，接种于相同增殖培养基，在相同条件下继续培养30d，得到增殖培养幼苗。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤4的具体步骤是：将步骤2中的萌生腋芽经步骤3中的增殖培养获得的高度3～4cm无根幼苗单株切下，接种于生根培养基上，置于光照强度1000～2000Lux，光照12小时/天，昼温25±2℃，夜温20±2℃的条件下光照培养15～20d，得到富民枳生根苗。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤2中的腋芽启动培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L。

8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤3中的增殖培养基为WPM+6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L+吲哚丁酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L+活性炭0.1g/L。

9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，其特征在于：所述步骤4中的生根培养基为WPM+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸1.0mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂4.0～4.5g/L+活性炭0.15～0.2g/L，或WPM+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸1.0mg/L+麦芽提取物1.5mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂4.0～4.5g/L+活性炭0.15～0.2g/L。