[发明专利]一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法

权利要求书

1.一种狂犬病病毒重组毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：以狂犬病病毒株rHEP-Flury为骨架，分别将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示经密码子优化的大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因插入rHEP-Flury的G基因和L基因之间的假基因区；

S2：拯救筛选获得狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

S11：利用引物Get-F/Get-R扩增狂犬病病毒株rHEP-Flury的G蛋白膜外抗原区基因片段，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物Get-F/Get-R的核苷酸序列分别如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

S12：利用核酸限制性内切酶对G蛋白膜外抗原区基因片段和质粒进行双酶切处理；将两者的酶切产物进行连接，获得重组质粒pHEP-Get；

S13：利用引物LTB-F/LTB-R扩增大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物LTB-F/LTB-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

S14：利用核酸限制性内切酶分别对大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因片段和所述S12中得到的重组质粒rHEP-Get进行酶切处理，将两者的酶切产物连接，获得重组质粒pHEP-Get-LTB。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S11中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Pst I和Nhe I酶切位点。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S13中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Nhe I和Age I酶切位点。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：

S21：在细胞培养板中培养BHK-21细胞；

S22：配置溶解液；

S23：将S22中得到的溶解液转染BHK-21细胞后，将BHK-21细胞继续培养；

S24：将BHK-21细胞避光反复冻融后离心，取上清液和新鲜的BHK-21细胞混合培养；

S25：弃去细胞培养液，细胞固定后，每孔加入抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体，进行孵育，自然干燥后荧光显微镜下观察，显微镜下的绿色荧光斑点为阳性，即为拯救成功，拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-Get-LTB。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S22中，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀，添加Opti-MEM培养基和转染试剂，轻轻吹打混匀，室温静置后，加入含血清的DMEM培养基，混匀后即得到溶解液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S25中，采用预冷的丙酮对细胞进行固定处理。

9.根据权利要求1-8中任意一项方法制备得到的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。

10.根据权利要求9所述的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB在制备狂犬病疫苗领域的应用。