[发明专利]一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡，获得卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛；

所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列₁-STa蛋白-柔性连接序列₁-STb蛋白，所述柔性连接序列₁的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG；

所述混合抗原进一步含有K88全菌灭活苗；

所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，K88全菌灭活苗1.0×10⁹-5.0×10⁹cfu；

卵黄抗体的提取方法为聚乙二醇沉淀，所述聚乙二醇沉淀提取卵黄抗体包括如下步骤：将卵黄与缓冲液混合后，加入聚乙二醇使其终浓度为2-5W/V％，搅拌后离心，取上清过滤，滤液中加入聚乙二醇使其终浓度为7-10W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解，加入聚乙二醇使其终浓度为10-15W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解并透析；

所述三价肠毒素融合蛋白的制备包括如下步骤：1)构建带有融合蛋白基因的质粒载体；2)转化宿主细菌；3)诱导表达目的蛋白；4)提取纯化目的蛋白；

所述步骤4)提取纯化目的蛋白，进一步包含以下步骤：离心收集菌体细胞，破碎菌体收集包涵体，裂解包涵体，采用亲和层析柱纯化目的蛋白，透析以使变性的目的蛋白复性；其中，采用镍亲和层析柱纯化目的蛋白，先用结合缓冲液清洗柱子除去杂蛋白，同时平衡柱子，然后以洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液，所述洗脱缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、350-450mM咪唑和7-9M尿素；所述结合缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、15-25mM咪唑和7-9M尿素。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:2～2:1。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg；K88全菌灭活苗为每只鸡每次1.0×10⁹-5.0×10⁹cfu。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.5mg。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，K88天然菌毛为每只鸡每次0.5mg。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，K88全菌灭活苗为每只鸡每次2.5×10⁹cfu。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:2；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2。

8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇沉淀提取卵黄抗体包括如下步骤：将卵黄与缓冲液混合后，加入聚乙二醇使其终浓度为3.2-3.8W/V％，搅拌后离心，取上清过滤，滤液中加入聚乙二醇使其终浓度为8.2-8.8W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解，加入聚乙二醇使其终浓度为11.5-12.5W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解并透析。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇为PEG2000～PEG6000。