[发明专利]一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法

权利要求书

1.一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将第2-10代小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化下来，离心和重悬，进行传代；

步骤二、将消化下来的细胞悬液，再稀释成相应的细胞浓度，在不同孔径大小的细胞板中进行铺板，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁；

步骤三、向不同的孔中加入不同浓度的油酸（Oleic acid ，OA）进行诱导，在37℃，5%CO₂的细胞培养箱中孵育24h，完成诱导；

步骤四、将诱导成功的脂肪细胞，进行油红O染色，在显微镜下观察。

2.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，3T3-L1细胞接种的细胞培养瓶为T25。

3.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述消化的步骤为：将T25细胞培养瓶中的上清液吸出，加入1-2mlPBS，轻轻摇晃，再将PBS吸出，加入1-2ml 0.25% Trypsin-EDTA ，消化2-5 min，待细胞变圆不再贴壁，加入2-4ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基终止消化。

4.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述离心和重悬的步骤为：将消化后的细胞从细胞培养瓶中吸出，收集到15ml 离心管中，在1000-1500 r/min下离心五分钟，然后去除上清液，加入3-5ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行重悬。

5.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述传代为：将重悬的细胞吸取1-2ml加入T25细胞培养瓶中，继续培养。

6.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤二铺板的具体操作如下：将细胞悬液轻轻吹打，使其均匀分散，吸出10ul加入细胞计数板中，计算出总的细胞密度，将细胞密度稀释至1×10⁵-2×10⁵个/ml，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml，将板轻轻晃动，使细胞均匀平铺，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁。

7.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤三中添加的油酸浓度分别为：20-1000μM，用含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行配制，将细胞板中上清液去除，加入配制好的不同浓度的油酸，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml。

8.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤四中油红O染色的方法为：步骤一、去除上清液，用PBS洗1-2遍，加入4%多聚甲醛固定15-30min；

步骤二、去除固定液，用PBS洗1-2遍，加入油红O染色30-60min；其中油红O染料是由油红O：去离子水=3：2配制而成；

步骤三、去除油红O染料，加60%异丙醇洗1-2次；

步骤四、去除异丙醇，用PBS洗1-2遍，最后用PBS浸润，在显微镜下观察。