[发明专利]一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法在审
| 申请号： | 201810977632.1 | 申请日： | 2018-08-24 |
| 公开（公告）号： | CN109097328A | 公开（公告）日： | 2018-12-28 |
| 发明（设计）人： | 魏志璋;黃馨萍 | 申请（专利权）人： | 深圳市浊安认证生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0775 | 分类号： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 北京细软智谷知识产权代理有限责任公司 11471 | 代理人： | 王金宝 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市宝安*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 上清液 间充质干细胞 沉淀 种特异性 微囊泡 过滤 培养基培养 无菌离心管 分离效率 机械损伤 梯度离心 细胞碎片 无菌PBS 过滤膜 纳米级 无血清 去除 清洗 优化 | ||
1.一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)无血清的间充质干细胞的上清液的收集：首先进行间充质干细胞的培养，将细胞融合度达到60-70％的间充质干细胞，用PBS清洗，更换成无血清相关成分的培养基进行培养，待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；
(2)取所述初始上清液在进一步梯度离心2000g离心10min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的上清液；
(3)将所述离心后的上清液转移到离心管中，在10000g离心30min，收集到含有微囊泡的上清液；
(4)将含有微囊泡的上清液在70000g离心60min，得到含有外泌体的沉淀，清洗，然后再70000g离心70min，得到外泌体沉淀；
(5)将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到所述的特异性的间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(1)中培养间充质干细胞的培养基为浓度为5％的PLA的ɑ-MEM培养基或为浓度为15％的FBS的ɑ-MEM培养基。
3.根据权利要求2所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述的培养基放置在37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(1)更换成无血清相关成分的培养基为ɑ-MEM或DMEM/F12培养基，所述培养基中PLA或FBS的浓度均为0。
5.根据权利要求4所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，更换培养基后进行的培养时间为48-72小时。
6.根据权利要求1所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(1)中离心的条件为300-500g离心5-10min。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(2)-(4)中离心的温度为4℃。
8.根据权利要求1所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(5)中加入的180-220ul无菌PBS。
9.根据权利要求6所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(5)中过滤膜的孔径为0.1um。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，外泌体提取的每一步骤均在无菌的条件下进行操作。
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