[发明专利]人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种人HLA‑F单克隆抗体及其制备方法，将合成基因HLA‑F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒转入表达菌株，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株利用IPTG进行诱导表达，得到目标蛋白HLA‑F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA‑F蛋白对小鼠进行快速免疫，再利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆，得到强阳性细胞株进行腹水制备，纯化处理腹水后，得到所述人HLA‑F单克隆抗体，不仅适用于蛋白免疫印记、ELISA，而且适用于免疫共沉淀、免疫荧光及中和抗体。可阻断肿瘤细胞对NK细胞免疫功能的抑制作用，激活NK细胞靶向杀伤肿瘤细胞。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen HLA)表达改变是肿瘤细胞逃避机体免疫的机制之一，HLA可以辅助肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的识别和杀伤，在各种恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。虽然HLA-I类分子表达下调可以帮助肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的识别和杀伤，但同样增强了NK细胞的杀伤活性，然而研究发现HLA-I缺陷的肿瘤细胞仍具有较强生长优势，进一步分析证实由于这些细胞过表达非经典HLA-I类分子(HLA-E，F，G)，进而导致肿瘤细胞免疫逃逸。HLA-F作为新近发现的第三种非经典HLA-I类分子，其功能及临床意义研究刚刚起步。与HLA-E相似，HLA-F可结合抑制性受体CD94/NKG2A，抑制NK细胞及部分CD8+T细胞的杀伤活性，逃避机体免疫杀伤。但是，目前市面上HLA-F抗体多以检测蛋白免疫印迹为主，尚不能作为中和抗体使用。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明所述HLA-F单克隆抗体能与HLA-F特异性结合，不与人类HLA-I类其他分子结合；不仅适用于蛋白免疫印记(WB)、ELISA，而且适用于免疫共沉淀(IP)、免疫荧光(IF)及中和抗体。当结合到人肿瘤细胞上的HLA-F时，可阻断肿瘤细胞对NK细胞免疫功能的抑制作用，从而激活NK细胞靶向杀伤肿瘤细胞。本发明还涉及包括所述人HLA-F单克隆抗体或其片段的药物组合物在制备用于治疗肿瘤患者的药物中应用。

本发明所采用的技术方案为：

一种人HLA-F单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将合成基因HLA-F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)-HLA-F；

(2)将质粒pCzn1(+)-HLA-F转入表达菌株，得到载体融合蛋白；之后采用IPTG诱导所述载体融合蛋白进行表达，得到目标蛋白HLA-F包涵体；

(3)对步骤(2)所述目标蛋白HLA-F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA-F蛋白；

(4)利用步骤(3)所述纯化后HLA-F蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆；

(5)筛选经步骤(4)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理后，即得所述人HLA-F单克隆抗体。

步骤(2)中，所述表达菌株为大肠杆菌TM。

将所述质粒pCzn1(+)-HLA-F转入所述表达菌株的具体操作如下：