[发明专利]基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的引物及其试剂盒与方法

权利要求书

1.一种基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的引物，包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物F3：AAGGCAACTTACTGATAGAATGT

外引物B3：TCCTCCGTGGATTGTTCT

内引物FIP：GCAACGGTCACCAGACTCCACAACGGAGTGACCTCT

内引物BIP：CCGCAGTATTCTGATTACCAGCAGGAAGTAATCCTCC

GATAGAGA

环引物LF：TCCAACAAGGTACTCACAGC

环引物LB：TTGGAATGGTACTCCTCAACTG。

2.如权利要求1所述的基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的引物，其特征在于：扩增反应时，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB和外引物F3和B3的摩尔比为8：4：1。

3.一种基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物。

4.如权利要求3所述的基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMP Supermix；(2)无RNA酶的超纯水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)病毒总DNA提取试剂。

5.如权利要求4所述的基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：所述2×ddLAMP Supermix包含以下试剂：内引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，环引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，250mmol/L KCl，200mmol/L MgSO₄，250mmol/L(NH4)₂SO₄，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜碱，10mmol/LdNTP，Bst大片断DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNase Cocktail。

6.如权利要求4所述的基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：阳性对照为猪猪圆环病毒2型DNA，阴性对照为去离子水。

7.一种基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)病毒DNA的提取

1)取待检样品1g，加入600μL裂解液A研磨后，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；

2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

3)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

4)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；

6)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μL，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板DNA；

(2)数字LAMP操作

1)待检样品、阴性对照和阳性对照每个反应管各加入数字LAMP反应液19μL；分别取1μL模板DNA，加入相应的反应管中，配置成20μL数字LAMP反应体系；所述模板DNA包括待检样品、阴性对照和阳性对照；

2)将20μL样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；

3)将微滴转入PCR板中，放入PCR仪中进行扩增；

4)将扩增完成的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；

5)结果判定及描述：阳性对照：40±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。