[发明专利]一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法

说明书

本发明公开了一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。通过胎肝单细胞悬液制备，胎肝HSCs移植的操作步骤，本发明的方法能高效重建血液系统，造血安全、稳定、可靠，且能高质量地对地贫小鼠进行有效治疗，治疗后的血液学参数，病理学指标接近于正常个体，这对于未来临床开发胎肝造血干进行血液性等疾病的高效治疗储备了技术体系基础。

技术领域

本发明属于造血干细胞制备技术领域，具体涉及一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是可自我更新并能向各系血细胞分化的一类细胞。HSCs移植可对恶性血液病、遗传代谢性疾病和先天性免疫缺陷等相关疾病进行治疗。目前造血干细胞的来源主要是骨髓HSCs和脐带血HSCs，但供体细胞来源紧张，致使可受治患者的数量极其有限，因此探寻新型的可移植造血干细胞具有迫切的临床需求性。HSCs除了个体体内获取，其它研究较多的是通过多能性干细胞体外分化形成，或通过体细胞的转分化形成。但体外分化或转分化方式目前均不能有效的得到具有移植造血重建功能的HSCs。这是因为在胚胎发育过程中，造血细胞如何形成？在其形成的调控机制还未阐明。8.5-9.5d小鼠胚胎卵黄囊的造血岛开始发生原始造血，随后造血区域转移至主动脉-性腺-中肾，其它的研究则发现这一时期的胎盘、头部和脐动脉中也出现造血干细胞。10.5d后胎肝造血开始发生，16d后，胎肝造血逐渐向骨髓髓内造血变化。刘兵团队在胚胎早期成功地获得了造血干细胞前体(pre-HSC)，并经分析鉴定，CD201为这类细胞的表面标记，随后他们与兰雨课题组今年在cell research杂志上首次揭示出在在小鼠胚胎发育的过程中，AGM区HSCs及其前体细胞的功能具有异质性，这种功能不同的细胞具有时空差异特征，其中淋系髓系平衡型(β型)具有较高的自我更新能力和造血重建潜能，这些突破性的研究为探寻胚胎发育早期主要功能性造血重建的HSCs类型及造血干相关的再生医学提供了理论论据。13.5天胎龄的小鼠胎肝中含有丰富不同分化阶段的肝干细胞、HSCs和间充质干细胞，相比较骨髓HSCs，其造血体系可能含有增殖分化潜能更强的HSCs，且整个体系的免疫原性和免疫活性更低。且由于其造血区域相对集中，因此研究胚胎期髓外造血、挖掘具有造血功能作用的胎肝细胞，以及分析微环境支持细胞对于造血形成和造血维持的调控作用，对于进一步分析造血形成机制及造血干细胞的开发应用均有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。

一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法，按照如下步骤进行：

(1)胎肝单细胞悬液制备：取哺乳动物胎肝，用枪头打碎成单细胞，细胞滤器过滤，除去细胞团块，用Ficoll分离液分离出单核细胞；

(2)胎肝HSCs移植：配置单核细胞悬液，通过骨髓腔内注射方法，对受体进行骨髓腔内注射。

所述哺乳动物为人，鼠，猴，牛或羊。

所述单核细胞悬液的注射量为1×10⁵/20ul-1×10⁷/20ul。

本发明的有益效果：本发明用密度梯度离心法，分离获得的红系高表达GFP的转基因小鼠13.5天胎肝或WT小鼠的单核细胞作为供体细胞，采用IBMI移植方法，对¹³⁷Cs照射的野生型小鼠进行造血系统重建的研究。移植7天后，荧光镜检小鼠骨髓涂片和血液涂片可观察到GFP+的细胞，表明供体细胞已经随着骨髓和血液系统的被运输到全身各处，并有效地向血系细胞分化。通过血涂片周期性镜检观察，可能看到HS23胎肝供体细胞在第5周外周血GFP荧光细胞最多，说明造血此时或之前形成高峰，说明造血功能开始稳定。为有效治疗α或β地中海贫血、骨髓障碍性贫血、重症免疫缺陷等疾病开辟了新的方案。

附图说明