[发明专利]一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法

说明书

本发明提供一种将GREM1作为标志物应用于检测间充质干细胞的生成骨细胞的能力，本发明的方法不依赖病毒转染这种基因工程技术，借助细胞倍增时间这种量化指标，结合低氧培养这种经济、适用的手段即可精准筛选出可促进骨细胞生成的高表达GREM1的间充质干细胞，通过检测间充质干细胞上清液中GREM1的含量，当GREM1的含量在5.37μg/ml以上，得到的间充质干细胞具有良好的分化成为骨细胞的能力，具有治疗骨损伤和促进骨修复能力，本发明提供的方法不仅操作简单，省时省力，还降低检测费用的经济成本，实践性强。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为细胞治疗的理想种子细胞，经过长期体外和动物疾病模型治疗的研究，已经被广泛地应用于临床上损伤、衰老等病变引起的各种组织器官损伤修复，主要包括骨重建和再生、神经退行性病变和损伤、心肌损伤、肝硬化、糖尿病、肺部疾病等。其中，间充质干细胞在骨科相关疾病运用最早，如骨关节炎、股骨头坏死、脊髓损伤、成骨发育不全和低磷酸酯酶症等，它相应的临床安全性和有效性已经得到了初步的验证，但治疗效果还是有一定的差异性。客观分析原因发现间充质干细胞在骨科治疗中依旧存在许多问题，如：(一)细胞制剂方面：①不同来源、不同状态的间充质干细胞数量和质量具有异质性；②大多数机构都采用单纯的贴壁法分离培养MSCs，细胞的纯度和干性不能保证；③如何保证注射后的MSCs具有一定的生物安全性。(二)临床疾病方面：①不同骨科疾病种类复杂多样，如何制定合理的个体化治疗方案，包括制定MSCs注射方式、剂量、次数、时间窗等；②如何调控MSCs在体内的增殖和分化，实现真正的“根治”效果。这些问题都要多方面机构共同协商和解决才能将问题迎刃而解，才能确保MSCs在相关适应症治疗中的治愈效果，才能推动MSCs在治疗中的应用研究。因此，我们先从间充质干细胞制备工艺、细胞质量以及生物活性多方面评估方面入手，拟开发并鉴定、筛选出一种可以真正维持“干性”和并促进机体骨细胞的分化的特异性间充质干细胞，以确保间充质干细胞在临床试验前的“生物活性”。

目前，关于间充质干细胞具有促骨细胞生成和骨修复潜能的生物标记物，在骨修复方面，大多数集中在生物材料搭建MSCs的治疗研究、小分子或者培养体系改造MSCs的研究(即非基因编辑技术改造的MSCs)和基因编辑技术改造MSCs的治疗研究三大类。

但是目前针对上述理论的研究还存在一些问题：

(1)中国专利CN107849533A“间充质干细胞用于治疗骨关节炎的用途”中公开了经低氧培养(低于10％氧气)的MSCs不仅可以增强其在体内的存活能力，还能促进血管损伤和骨关节炎等疾病的修复功能，这是一种非常简易、高效的方法。但是低氧培养间充质干细胞的主要目的是延缓间充质干细胞的过渡扩增造成的细胞衰老，避免一些衰老的间充质干细胞在正常氧浓度条件下造成氧化应激损伤。这种低氧培养条件下的间充质干细胞最终能扩增的代数，细胞能维持的最适应特性情况都需要继续研究。而专利CN105441389A“促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法”中公开了采用a-MEM+5％血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1这种培养体系可以提高骨髓间充质干细胞内决定成骨再生的关键转录因子(Osterix、RUNX)的基因以及骨再生早期代表性因子的基因-骨桥蛋白(OPN)和碱性磷酸酶(ALP)的表达。但是这种基因高表达的方法需要复杂的培养体系，最终还需要适合的检测手段。

(2)基因编辑修饰的MSCs方面：

虽然CN107828719A：“GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用”和CN104004711A：“一种提高人间充质干细胞分化能力的方法”均公开了可以提高间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，但是这种方法目前还仅处在动物实验研究，尤其转染基因的分布及表达情况缺乏有效的检测方法、其安全性的问题仍然阻碍其临床应用。最重要的获取可用于临床应用的载体非常耗时且耗费高。因此，经基因修饰的MSC离临床应用仍尚有距离。