[发明专利]一种同时表达HA和HEF的复制缺陷型重组流感病毒

说明书

本发明提供一种复制缺陷型A、D二价流感病毒弱毒活疫苗制备方法。本发明构建了一种重组病毒株，在没有改变基因稳定性前体下，构建的重组病毒可稳定的同时表达A型流感病毒H1N1亚型的表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一的表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF。所构建的弱毒株不仅具有良好的基因稳定性而且在实验动物体内不能复制，所以并不具备致病性，同时还可诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平，保持强烈且持久的免疫原性。最关键的是，该疫苗侯选株可对A型流感病毒H1N1亚型和D型流感病毒均可产生免疫保护作用。那么对于A型和D型流感的预防与控制具有巨大的社会意义。

技术领域

本发明属于流感病毒疫苗技术研发领域，具体涉及一种可同时表达A型流感病毒H1N1表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF的重组流感病毒的制备方法及用途。

背景技术

流感是由流感病毒(Influenza Virus)引起的严重危害人和动物呼吸道系统的传染病。跟据其核蛋白抗原性不同将流感病毒分为A、B、C三型(IAV、IBV、ICV)，感染人的流感病毒主要是A型和B型。D型流感病毒(IDV)是近年来发现的一种新型流感病毒，感染人和哺乳动物。

目前流感疫苗是预防和控制流感病毒流行的主要方法，常用的流感疫苗有灭活苗和弱毒苗：灭活苗存在问题主要是抗原性差，只能诱导抗体免疫；弱毒流感疫苗是低温适应流感病毒株，能同时诱导较强的抗体免疫应答和细胞免疫应答反应，但是目前批准的弱毒流感疫苗毒株只能表达一个亚型的HA，并且低温适应毒株研发的周期长，还有潜在的毒力回复突变的潜在危险；而且目前还没有针对D型流感病毒的疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：研究开发一种复制缺陷型A、D二价流感病毒弱毒活疫苗制备方法。

本发明首先提供一种复制缺陷型重组流感病毒的制备方法，所述方法包括如下的步骤：

1)合成包含有D型流感病毒表面糖蛋白-血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框、A型H1N1流感病毒NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的DNA片段，将合成的DNA片段插入到载体质粒pHW2000上，构建成重组质粒pHW-NA-HEF；

其中DNA片段，其一种具体的序列为SEQ ID NO:1；

2)将步骤1)构建的重组质粒pHW-NA-HEF与用于表达A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS基因的重组质粒共同转染293T细胞和稳定表达流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞；

所述的NA基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2；

3)收集转染后293T细胞和MDCK细胞的上清培养液；

4)在稳定表达A型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA基因的MDCK细胞系上拯救并扩增重组流感病毒；

本发明另一个方面提供一种重组病毒株，该病毒株是用上述方法构建的；

构建的重组病毒株能够用来制备疫苗；

所述的疫苗，为弱毒活疫苗。

本发明构建了一种重组病毒株，在没有改变基因稳定性前体下，构建的重组病毒可稳定的同时表达A型流感病毒H1N1亚型的表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一的表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF。所构建的弱毒株不仅具有良好的基因稳定性而且在实验动物体内不能复制，所以并不具备致病性，同时还可诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平，保持强烈且持久的免疫原性。最关键的是，该疫苗侯选株可对A型流感病毒H1N1亚型和D型流感病毒均可产生免疫保护作用。那么对于A型和D型流感的预防与控制具有巨大的社会意义。

附图说明