[发明专利]一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及其构建与应用

权利要求书

1.一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述黑曲霉基因工程菌株是过表达黑曲霉来源的丙酮酸羧化酶基因pyc和黑曲霉来源的苹果酸脱氢酶基因mdh、异源表达米曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白C4T318基因并敲除了草酰乙酸水解酶基因oahA的黑曲霉基因工程菌株；

构建步骤如下：

(1)构建表达pyc基因质粒

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p994/p995为引物，通过PCR反应扩增获得基因pyc序列片段；经Spe I和Hind III双酶切pyc序列片段和经同样双酶切载体pLH331，将所述基因pyc序列片段克隆到载体pLH331，构建基因pyc表达质粒pLH395；

(2)pyc基因过表达菌株的获得

将所述质粒pLH395转化至宿主菌株S469，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因过表达菌株；

(3)构建表达mdh基因质粒

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p819/p820为引物，通过PCR反应扩增获得基因mdh序列片段；经EcoR I和BamH I双酶切mdh序列片段和经同样双酶切载体pLH331，将所述基因mdh序列片段克隆到载体pLH331，构建基因mdh表达质粒pLH373；

(4)pyc基因和mdh基因共过表达菌株的获得

将所述质粒pLH373转化至pyc基因过表达菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因和mdh基因共过表达菌株；

(5)构建表达C4T318基因质粒

以野生型米曲霉NRRL 3488基因组为模板，以p1176/p1177为引物，通过PCR反应扩增获得基因C4T318序列片段；经EcoR I和Kpn I双酶切C4T318序列片段和经同样双酶切载体pLH454，将所述基因C4T318序列片段克隆到载体pLH454，构建基因C4T318表达质粒pLH455；所述质粒pLH455的结构如图6所示；

所述基因C4T318由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列长度为932bp；

(6)pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株的获得

将所述质粒pLH455转化至pyc和mdh基因共过表达菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株；

(7)构建基因oahA敲除质粒：

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p953/p954为引物，通过PCR反应扩增获得基因oahA的上游序列片段；经EcoR I和BamH I双酶切oahA的上游序列片段和经同样双酶切载体pLH314，将所述oahA的上游序列片段克隆到载体pLH314，构建质粒pLH314：：oahA-5’f；

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p955/p956为引物，通过PCR反应扩增获得基因oahA的下游序列片段，经Spe I和Hind III双酶切oahA的下游序列片段和经同样双酶切质粒pLH314：：oahA-5’f，将oahA的下游序列片段克隆到质粒pLH314：：oahA-5’f，构建基因oahA敲除质粒pLH398；

(8)pyc和mdh基因共过表达、异源表达C4T318基因且oahA基因敲除菌株的获得；

将所述质粒pLH398转化至pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因和mdh基因共过表达、异源表达C4T318基因且oahA基因敲除菌株；

所述步骤(2)宿主菌株S469的构建方法如下：

(1)含有loxP-hph-loxP元件质粒的构建

将loxP-hph-loxP元件序列经BamH I和Pst I酶切，连接克隆到经同样双酶切的载体pFGL59Ble构建质粒pLH314；pLH314经XhoI单酶切后连接得到质粒pLH331；pLH314用于构建敲除质粒的出发载体；以黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p635/p636和p637/p638为引物，分别扩增pyrG基因两端的DNA序列，然后分别克隆到载体pLH314构建pyrG敲除质粒pLH323；

(2)含有Tet-on-cre元件质粒的构建

Sal I单酶切载体pFGL59将hph抗性基因去除，回收载体片段后经T4 DNA连接酶连接获得pLH309；以黑曲霉ATCC1015基因组为模板，以p603/p604为引物，经PCR扩增pyrG及其自身启动子和终止子，经Sma I和Xba I双酶切后连接到经同样双酶切的质粒pLH309得到质粒pLH310；cre经密码子优化后，Tet-on-cre序列经Spe I和Nco I双酶切，克隆到经同样双酶切的载体pLH310得到Tet-on调控Cre表达的质粒pLH409；pyrG扩增产物经测序验证未有突变；

(3)Cre-loxP遗传操作系统的构建

为了将cre表达元件成功整合到黑曲霉基因组且不残留外源的抗性标记基因，因此选用pyrG为筛选标记进行转化；以pyrG为筛选标记进行转化的前提是出发菌株为pyrG缺陷菌株，即尿嘧啶营养缺陷菌株ΔpyrG；因此首先通过农杆菌介导转化的方法将pLH323转化到黑曲霉野生菌株ATCC1015中，经双交换同源重组得到pyrG敲除菌株ΔpyrG S296；在同源臂以外的序列上设计引物p639/p640，提取S296基因组为模板，经PCR验证pyrG基因被敲除；

由于pyrG部分序列被loxP-hph-loxP取代，得到的转化子具有尿嘧啶营养缺陷和潮霉素抗性的特点，因此S296必须在补充有尿嘧啶的培养基中培养；

以ΔpyrG S296为出发菌株，通过农杆菌介导转化质粒pLH409，将由Tet-on调控表达的cre基因整合到S296基因组得到菌株S462；由于pLH409转化过程是以pyrG为筛选标记，所以得到的阳性转化子中pyrG基因得以回补成为尿嘧啶原养型，即出发菌株的尿嘧啶营养缺陷表型得以恢复；提取S462基因组，以p1109/p604为引物，经PCR验证Tet-on-cre元件是否整合到基因组；

为了重组去除S462菌株中的hph marker，将黑曲霉S462的孢子300个，均匀涂布在含有10μg/mL强力霉素的MM培养基中进行诱导培养至长出单克隆，挑取100个单克隆同时接种于PDA培养基和含有250μg/mL潮霉素的PDA培养基中，在含有250μg/mL潮霉素的PDA培养基中筛选潮霉素敏感克隆，用PCR验证hph marker的去除，选择其中一个正确的克隆，命名为S469；该S469菌株即为构建高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的宿主菌；

所述S469菌株是在基因组内整合了外源cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达，当以所述菌株S469为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，可通过强力霉素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达或敲除且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留；

所述引物p994/p995的核苷酸序列为：

p994：GGACTAGTAGAGTCCGATGTTGCTGG，

p995：CCAAGCTTCTTCTGAATAAATGGAGGTT；

所述引物p819/p820的核苷酸序列为：

p819：CGAGCTCTCCAGAAGTGACTAAGCAAC，

p820：CGGGATCCTACAGTATACGTTCATCACT；

所述引物p1176/p1177的核苷酸序列为：

p1176：GGAATTCATGTTCAATAACGAACACCACATTCCA，

p1177：GGGGTACCGGGAGTAACGCCGTGAGATGC；

所述引物p953/p954的核苷酸序列为：

p953：CGGAATTCGAGCCCTGGCAGTCTATCGG，

p954：CGGGATCCAGAAAGAGGCTTGTTTGAGACTGAT；

所述引物p955/p956的核苷酸序列为：

p955：GGACTAGTTTTGTTTCACCCAGCAGAACCTTA，

p954：CCCAAGCTTATCGGCAAGGAGCGTCGTCT；

所述引物p635/p636的核苷酸序列为：

p635：CCGGAATTCCTTGCAGACAATGCCATTCT，

p636：CGGGATCCATTGGGATGCTTGCTGGCAC；

所述引物p637/p638的核苷酸序列为：

p637：GCTCTAGAGAGGATCGAAGTTCTGATGGT，

p638：CAGGGCCCTTCTCATCCGCCATGTTAGAT；

所述引物p603/p604的核苷酸序列为：

p603：TCCCCCGGGACTAGTGAATTCCTCGAGCCATGGCTCACTGTTCCTTTACGGAT，

p604：GCTCTAGAGCTGACGCTGACTTGGATGC；

所述引物p639/p640的核苷酸序列为：

p639：AGTCATAGCAGATTCAAGCT，

p640：GTCTGCATCCTTCGTATGCT；

所述引物p1109的核苷酸序列为：

p1109：CGGAGAATATGGAGCTTCATCGAATCAC。

2.根据权利要求1所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：将所述构建的黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养平板上在28℃培养6天直至产生分生孢子，将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的终浓度为2×10⁶孢子/ml，在28℃，220rpm培养7天；

所述发酵培养基组成为：100g/L glucose,80g/L CaCO₃,6g/L Bacto Peptone,150mg/LKH₂PO₄,150mg/L K₂HPO₄,100mg/L MgSO·7H₂O,100mg/L CaCl₂·2H₂O,5mg/L FeSO₄·7H₂O,5mg/L NaCl。